بيماري برونشيت عفوني، از بیماریهای حاد سيستم تنفسي ماکیان است. از علایم مهم بالینی آن رال‌هاي نايي، عطسه و سرفه است. IBV سروتیپ های متعددی دارد،از اینرو هزینه های صرف شده جهت ایجاد ایمنی در برابر این بیماری بسیار بالا ست.
در جوجه‌هاي گوشتي، مرگ و مير در دو هفته آخر دوره پرورش(6-5 هفتگي) به حداكثر خود مي‌رسد و بيشتر مرگ و میرها، ناشی از عفونتهاي باكتريايي است. ويروسIB، در سیستم تنفسی پرنده جایگزین شده و پس از ایجاد ضایعۀ اولیه، شرایط را برای عفونت باکتریها میسر می سازد.
بعضی از سويه‌هاي ويروس IB،باعث ایجاد ضایعه در کلیۀ پرنده شده ودر جوجه‌هاي جوان مرگ و میر تا 30 درصد را موجب می شوند.
ويروس در اويداكت پرنده تكثير یافته و كاهش تولید 50-10 درصدي درمرغهاي تخم گذار را موجب مي‌شود.در این فرم از بیماری، تعداد تخم مرغهاي تغيير شكل و تغییر رنگ یافته افزايش پيدا کرده و میزان توليد معمولاً به وضعيت طبيعي‌باز نمي‌گردد.
در بيشتراوقات ، سويه‌هاي ويروسي جداشده از همه گيري‌هاي بيماري IB، متفاوت از نوع ويروس به كار رفته در واكسن می باشد.
اتيولوژي:
ويروس IB عضوي از خانوادۀ كروناويريده است.اين خانواده‌شامل دو جنس كروناويروس و تورو ويروس بوده و ويروس IB در گروه سوم جنس كروناويروسها قراردارد.
تعدادي از كروناويروسهاي جدا شده از بوقلمونها شباهت زيادي به ويروس IB داشته و در گروه 3 قرار دارند. تاکنون هيچ نوع تورو ويروس پرنده‌اي تأييد شده‌اي يافت نشده است. از طرفی توالی ژنومی كروناويروسهاي جداشده‌از قرقاولها شباهت زيادي با ويروس IB دارند.
مورفولوژي:
ويروس IB ، گرد، چند شكلي ، واجد غشاء و تقريباً 120 نانومتر است.برجستگيهاي سطحي چماقي شكل، به طول 20 نانومتر در سطح ویروس وجود دارند. تظاهر كروناويروسها و توروويروسها در زیر ميكروسكوپ الكتروني شبيه هم است.
سانتريفوژ با دور بالاي 100000 و یا انكوباسيون ویروس در دماي C37 درجه موجب از دست رفتن برجستگيهاي سطحي و یا ساب يونيت 1S مي شود.
تركيب شيميايي:
ويروس IB واجد سه پروتئين ساختاري عمده برجستگيهاي سطحي S، گليكوپروتئينهاي غشايي M و نوكلئوپروتئين داخلي N مي‌باشد. پروتئين چهارمي نيز بنام پروتئين E به مقدار كم در غشاي ويريون وجوددارد كه وجود آن جهت تشكيل ذرات ويروسي ضروري است.
پروتئين S شامل دو الی سه كپي از گليكوپيتيدهاي 1S و 2S مي‌باشد. كه؛ به ترتيب هريك واجد 520 و 625 اسيدآمينه هستند. دو خصوصیت ممانعت‌ازهماگلوتيناسيون (HI) و تحریک تولید بيشترآنتي‌بادي‌هايي خنثي كننده، توسط گلیکوپروتئین 1S ايجاد مي‌شود.
تنها 10% از پروتئين M در سطح‌خارجي ويروس ظاهر مي‌شود.پروتئين N تكه منفردي از ژنوم RNA سنس مثبت تك رشته‌اي است كه؛ تقريبا دارای 27600 نوكلئوتيد بوده، تمامي آن تا به حال كلون و توالی ژنومی آن مشخص شده است.
تكثير ويروس:
ويروس برونشیت عفونی درسيتوپلاسم سلول میزبان تكثير می یابد، به اين صورت كه 6 عدد mRNA بااستفاده از مكانيسم رونوشت برداري غيرمداوم[1] توليد مي‌شوند. پروتئين S از شبکه اندوپلاسمي به سطح سلول مهاجرت می كند. ولي ؛ پروتئين M قادر به انجام چنین كاری نيست.
ويريون ها پس ازتشکیل از غشاي رتيكولوم جوانه زده و خارج می شوند و در وزيكول‌هاي صاف تجمع مي‌يابند ، اين جوانه زدن از سطح سلولي صورت نمي‌گيرد و مكانيسم آزادشدن آنهااز سلول ناشناخته مي‌باشد.
اولين ويروسها 3 الی 4 ساعت پس از آلودگي تظاهر پيدا مي‌كنند و حداكثر تیتر ويروس، پس از 12 ساعت ودر دماي37˚C دیده مي‌شود.
مقاومت در برابر عوامل فيزيكي و شيميايي:
گرما: بيشتر سويه‌هاي ويروس IB در دمایC ˚56 به مدت 15 دقيقه و در دماي˚C 45 به مدت 90 دقيقه غيرفعال مي شوند.
ويروس IB در دماي منفی C˚20 نبايستی نگهداری شود. بااين حال؛ ويروس پس از سالها ذخيره‌سازي در مايع‌آلانتوئيك عفوني در دمای منفی 30˚C زنده مانده است.ويروس در بافتهاي عفوني در 50 درصد گليسرول به خوبي حفظ مي‌شود و بدون نياز به‌انجماد، نمونه‌ها به آزمايشگاه ارسال می شوند. این ويروس در محيط خارج در فصل بهار تا 12 روز و در فصل زمستان تا 56 روز ماندگاري دارد.
لئوفيلیزاسيون:
ويروس ، در مايع آلانتوئيك عفوني لئوفيليزه شده، تحت شرايط خلأ و در يخچال به‌مدت 30 سال زنده‌مانده‌است. در حالتهاي لئوفيليزه ويخ‌زده ،اضافه نمودن 10 درصد گلوكز، ثبات بيشتري به ويروس IB مي‌دهد.
PH: مقاومت سويه های مختلف در برابر PH=3 متفاوت است،در یک مطالعه، بيشتر جدايه‌ها در PH=3 و دماي اتاق ،در‌مدت 4 ساعت به ميزان يك تا دو 10log کاهش تیتر داشتند ودر بعضي جدايه‌ها تا پنج10log نیز مشاهده شد.
عوامل شیمیایی : ويروس IB در برابر ضدعفوني كننده‌هاي معمولي حساس است.
با وجود حساسیت ویروسIB در برابر اتر ، يكسري از جدايه‌های این ویروس در برابر اتر20 درصد در دمای 4 درجه سانتی گراد ،بمدت18 ساعت ماندگاری داشتند.كلروفرم 50 درصد در دماي اتاق و در مدت ده دقيقه ،سديم داكسي كلات 0.1 درصد در دماي c4 و در مدت 18 ساعت، غلظت 05/0 درصد بتاپروپيونولاكتون (BPL) و فرمالين 0.1 درصد، همه آلودگی های ناشی از ویروس IB را از بین می برند.
تنها مواجهه با BPL هيچ گونه اثر سوء، بر روي فعاليت آنتي ژنيكي هماگلوتينين ويروس IB ندارد.
طبقه‌بندي سويه ها
طبقه‌بندي سويه‌اي و يا به عبارت دقيق‌تر طبقه‌بندي ژنوتيپي و سروتيپي ويروسIB ، بر اساس پروتئين S صورت مي‌گيرد.تا کنون دهها سروتيپ ويروس IB شناسايي‌شده و بدون شك تعداد سروتيپ‌ها بسيار بيشتر از اینهاست.
به طور سنتي ، سروتيپ‌هاي ويروسIB با استفاده از آزمايش VN شناسايي مي‌شوند. آنتي‌بادي ها در پاسخ به‌اپي‌توپ‌هايي كه توسط پروتئين 1S ساخته شده‌اند، ايجاد مي‌شوند.
تعدادي از آزمايشگاهها ،از آنتيباديهاي مونوكلونال استفاده‌مي‌كنند و هر کدام از این آنتی بادی ها فقط در برابر یک سروتیپ خاص کاربرد دارند. از این آنتی بادیها در آزمایش الایزا (که بسیار اقتصادی تر از آزمایشهای VN است) نیز می توان استفاده نمود.
امروزه آزمايشگاهها به طور روزافزوني از RT-PCR[2] استفاده مي‌كنند. در اين آزمايش كپي‌هاي ساب‌يونيت 1S پروتئين S توليد مي‌شود و آناليز اندونوكلئاز محدود شونده[3] و تعیین ترادف ژنومي انجام مي‌شود. روشهاي مبتني بر اسيدنوكلئيك، جدايه‌هاي ويروس IB را بيشتر بصورت ژنوتيپي (و نه سروتيپي)مشخص مي‌كنند.
بررسی ترادف ژنومی كروناويروسهاي جدا شده از بوقلمونها و قرقاولها در آمريكا نشان می دهد كه این ویروسها شباهت زیادی به ويروس IB دارند.
آناليز آنتي‌بادي سرمي:
در آمريكا و استراليا ،درطی سالهای 1960 و 1970 ميلادي، سروتيپ های متفاوت ازسروتيپ ماساچوست شناسايي شدند. پس ازآن، بررسيهاي انجام شده در آسيا واروپا تعداد جديدي از سروتيپ‌ها را مشخص ساخت.
آناليز خنثي‌سازي متقاطع[4] تعدادي از جدايه‌هاي سروتيپ آركانزاس وجود تحت تيپ‌ها را نیز معلوم ساخت. پاسخ اولیه آنتي‌بادي HI متعاقب مواجهه با ویروس IB و عفونت بعد از آن، بسيار اختصاصي است، به طوري كه حتي جدايه‌هاي Holland و M41 متعلق به‌سروتيپ ماساچوست را می توان از هم تفریق نمود.
محققي تست های HI و VN را با هم مقايسه کرده و عنوان نمود كه آزمایش HI ،واكنشهاي متقاطع زيادتر و متغيرتري دارد و آزمايش VN، سويه‌هاي ويروس IB را ازهمدیگر به صورت واضح تری تفریق می کند.
آناليز آنتيباديهاي مونوكلونال
جهت شناسایی نوع سروتيپ جدايه‌هايIB، آنتيباديهاي مونوكلونال‌ِ بر عليه اپي‌توپ‌هاي ساب‌يونيت 1S ساخته شده و در آزمايش VN مورد استفاده قرار می گیرند. اسيدهاي آمينه‌اي كه اپي‌توپ‌هاي VN را تشكيل مي‌دهند بيشتر بر روي‌چارك اول و سوم گليكوپپتيد 1S قرار دارند. آنتيباديهاي مونوكلونال در برابر سروتیپ هاي متعدد آمريكاي شمالي نظير ماساچوست، كانكتيكوت 46، آركانزاس 99، جدايه‌هاي اروپايي 274 D و گروههاي 1466 D و جدايه‌هاي استراليايي ساخته شده‌اند.
آناليز اسيد نوكلئيك:
تعیین ترادف کامل ژنومی سويه بيوديت و ژنوم پروتئین های ساختاري تعداد زيادي ازجدايه‌هاي ويروس IB انجام گرفته است و در این میان ساب يونيت 1S، بيشتر از همه قسمت ها سكوئنس شده است. پروتئین1S نمايانگر سروتيپ است و نقش عمده‌اي در ايجاد ايمني دارد.تفاوت های موجود در ترادف ژنومی ساب یونیت 1S ، باعث می شود كه عليرغم وجود پاسخ ايمني توسط یک سروتيپ ،سويه‌هاي سروتيپ ديگر قادر به تكثير و ايجاد بيماري باشند.
در یک مطالعه، ترادف ژنومی 1S تعدادي از سروتيپ‌ها در حد 25 - 20 درصد و حداكثر تا 48 درصد با یکديگر تفاوت داشتند، پروتئين S1 سويه‌هاي كانكتيكوت46 و ماساچوست41 كه در سروتيپ‌هاي متفاوتي قراردارند؛ تنها 6/7درصد با یکديگر تفاوت داشت.تعدادي از سويه‌ها با جدايه 274Dutch تشابه اسيدآمينه‌اي بالاي 97درصد داشتند. ولی؛ بااستفاده از آزمايشهاي سرمي VN در سروتيپ‌هاي متفاوتي قرار گرفتند. از اينروحدس زده مي‌شود كه تنها اپي‌توپ‌هاي كمي از 1S، آنتيباديهاي عمده VN را ايجادمي‌كنند و وقوع موتاسيون های بسیار جزئی در اين اپي‌توپ‌ها، منجر به ايجاد سروتيپ‌هاي جديدی می شود. تعیین ترادف ژنومی S نشان می دهد كه سويه‌هاي ويروس IB در طي عفونتهاي مخلوط، دچار بازآرايي ژنتيكي می شوند.بنابراين شباهت بالای پروتئين S دو جدايه بدین معنی نیست كه آنها درديگر ژن‌ها نيز شباهت زيادي با یکديگر دارند.
ميزبانهاي آزمايشگاهي:
بيشتر جدايه‌هاي ويروس IB ، در كيسه آلانتوئيك تخم مرغ های جنین دار به خوبي رشد كرده وتيتر بالايي از ويروس، در مايع آلانتوئيك ايجاد مي‌شود.پس از تلقيح مقدار TOC310(10 به توان3) يا 50EID410 (10 به توان4) حداكثر تيتر ويروس در دماي c 37 ، پس از 36الی 40 ساعت ایجاد می شود.كروناويروسهاي جدا شده از قرقاولها نيز به راحتي از طريق اين روش تكثير پيدامي‌كنند.
كرونا ويروسهاي جدا شده از بوقلمونها به بافتهاي گوارشي و بورس فاربرسيوس تمايل داشته و در كيسه آمنيوتيك جنين بوقلمونها تكثير پيدامي‌كنند و ويروس از محتويات دستگاه گوارش جنين جدا مي‌شود.
در صورت تلقیح ویروس های فیلدی به جنین های 10 تا 11 روزه ماکیان ، كوتولگي تعدادي از جنين ها به همراه ماندگاري 90درصد بقيه جنين‌ها در روز نوزدهم انكوباسيون مشاهده می شود. بعضی از جدايه‌ها حتي پس از سه پاساژ نيز قادر به ايجادكوتولگي در جنين‌ها نیستند.
با افزايش تعداد پاساژهاي ويروس در جنين، كوتولگي جنين‌ها و میزان مرگ‌وميرشان‌افزايش مي‌يابد؛ به طوريكه در دهمين پاساژ رشد بيشتر جنين‌ها متوقف مي‌شود و بيشتر از 80% جنين‌ها تا روزبيستم دوره انكوباسيون تلف مي‌شوند. چند روز پس از تلقيح‌ويروس در تخم‌مرغ جنين‌دار تغييرات مشخص جنيني مشاهده مي‌شود: طي نوربيني تخم‌مرغها، جنين های كوتوله شده و حركات كمي دارند؛ جنين، پيچيده شده و به شکل كروي در مي‌آيد ؛ پاهاي جنين دفرمه شده و بر روي سر جنين قرار مي‌گيرد ؛ پرده‌آمنيون ضخيم‌تر شده و به جنين مي‌چسبد ؛ كيسه زرده چروكيده شده و غشاي آن‌به راحتي پاره مي‌شود.
معمول‌ترين ضايعه داخلي مشاهده شده در جنين‌هاي آلوده به ويروس IB، مزونفرون هايي است كه حاوي اورات هستند. اين ضايعه اختصاص به عفونت با ویروس IB نداشته و در جنين‌هایی که از رشد بازمانده اند مشاهده می شود.
در تلقيح جدايه‌هاي غيركشنده ويروس IB، آمنيون و لايه مجاورآلانتوئيس ضخیم مي‌شوند. اين ضايعه در روز سوم پس از تلقيح ديده شده وپاتاگونوميك نمي‌باشد و متعاقب تلقيح سويه‌هاي لنتوژن ويروس بيماري نيوكاسل نيز ایجاد مي‌شوند.
در تلقیح سويه 41M ويروس IB پرخوني، حاشيه نشینی اطراف رگي (PVC) و نكروز كبد در روز ششم پس از تلقيح مشاهده می شود.ريه‌ها پنومونيك بوده و پرخوني، نفوذ سلولي و اگزوداي سروزي در كيسه‌هاي برونشي، نفريت بينابيني كليه‌ها به همراه ادم و اتساع لوله‌هاي پروكسيما ل دیده مي‌شود.غشاي كوريوآلانتوئيك و آمنیوتيك ادماتوز مي‌شوند و اجسام‌تجمعي مشاهده نمي‌شود.
با وجود شواهدي مبني بر سازگاري و تكثير يكسري سويه‌هاي ويروس IB (بيوديت و M41) در جنين بوقلمون ، جنين بوقلمون ها جهت تكثير ویروس IB استفاده نمي‌شوند.
كشت‌هاي سلولي:
سلولهاي كليه جنين‌ماکیان (CEK)[5] وسلولهاي كليه ماکیان (CK)[6] به عنوان کشت های سلولی تک لایه جهت کشت ویروس IB به طور موفقيت‌آميزي بكار رفته‌اند. در صورت پاساژ ابتدايي ویروس در جنين ماکیان، ،ویروس ها به کشت سلولی CEK آسان تر سازگاري[7] می یابند.
اندازه و شكل‌پلاك تعدادي از سويه‌ها با یکديگر تفاوت دارد و اندازه پلاك يكسري از سويه‌ها در دماي c40درجه بزرگتر از دماي c37 درجه است.
فاز رشد تأخيري[8] ويروس IB در سلولهاي CEK و CK، 3الی4 ساعت بوده و حداكثر تیتر ویروس، در عرض 13الی 16 ساعت ايجاد مي شود.تيتر ویروس در سلولهاي كبدي جنين ماکیان، مشابه سلولهاي CEK است و تیتر ويروس IB در تخم‌مرغهاي جنين‌دار 100-10 برابر بيشتر از تیتر ایجاد شده در سلولهاي CK وCEK است.
با افزايش PH، ويروسها زودتر آزاد شده ولي سريع‌تر نيز غيرفعال می شوند. PH مناسب برای توليد ويروسهاي باثبات، 5/6 است.
سويه‌هاي ويروس IB كه در جنين ماکیان و كشت سلولي CK پاساژ داده شده‌اند؛در كشت سلولي فيبروبلاست جنين ماکیان تكثير پيدا مي‌كنند. ولي؛ تيتر ويروس پايين‌تر است. همچنين سويه بيوديت به طور موفقيت‌آميزي در خط سلولي هپاتوماي جوجه‌ها (LMH) كشت داده می شود.
كرونا ويروسهاي بوقلمونها كه ترادف ژنومي مشابه ويروس IB دارند، در كشت‌هاي سلولي تکثیر پیدا نکردند ولی در جنين بوقلمونها كشت داده شدند.
كشت ارگان
ويروس IB در حلقه‌هاي نايي جنين‌هاي جوجه بيست روزه تکثیر شده و 3الی4 روز پس از تلقيح، ويروس باعث توقف حركت مژكها مي‌شود.در كشت‌نايي ویروس IB ، جداسازي، تيتراسيون و تعیین سروتایپ ويروس بدون نیاز به سازگاري قبلي ویروس با موفقيت انجام می شود.
بيماريزايي
ويروس IB در بافت گوارشي، تنفسي، كليه‌ها ، اويداكت و غدد هاردرين ماکیان تكثير می یابد. جدايه‌هاي‌ويروس IB بدون توجه به بافت منشاء آن، مجراي تنفسي ماکیان را به آساني آلوده نموده و جراحات مشخصي را در ناي به وجود مي‌آورند.
حداقل يك سويه نفروپاتوژن ويروس IB بنام سويه T استراليايي شناخته شده كه پاسخ التهابي كمي در مجراي تنفسي جوجه‌هاي جوان ايجاد مي‌كند. این سويه، جزو سويه‌هاي حاد بوده و از عواملی است که باعث بروز ضايعات كليوي ومرگ‌ومير در ماکیان می شود.عفونتهاي ثانويه باكتريايي باعث التهاب كيسه های هوايي شده و عارضه‌كليوي متعاقب فاز تنفسي بيماري ایجاد می شود. درجوجه‌های آلوده به سويه Gray (نفروپاتوژن) ويروس IB ، بالا بردن كلسيم جيره غذايي منجر به ایجاد ضايعات‌كليوي و تشکیل سنگ كليه می شود.
ويروسهاي دیگرسروتيپ‌ها نيز براي كليه‌ها بيماريزا هستند. ولي؛ در مقايسه با سويه Tاستراليايي حدت كمتري دارند. اين ويروسها عبارتند از: سويه‌هاي آمريكايي Holte و Gray، سويه Mass-Holland 52 و جدايه 1648B بلژيك.
در حالت طبیعی ایجاد بیماری ،سويه‌هاي حاد ويروس IB بيماري تنفسي شديد به همراه مرگ‌ومير ایجاد می کنند. بيشترین مرگ‌ومير در خروس ها دیده می شود؛ در صورت وجود استرس سرمايي و يا وجود پروتئين حيواني به عنوان منبع عمده تأمين پروتئین در جيره‌هاي با پروتئين بالا، عوارض کلیوی نیز مشاهده مي‌شود.
مواجهه جوجه ها با ویروس IB ،به همراه استرس سرمايي و مايكوپلاسما سينوويه منجربه التهاب كسيه هوايي می شود كه شدت بیماری و ميزان شيوع آن به حدت سويه ويروس IB بستگی دارد. مايكوپلاسما گالي سپتيكوم* و مايكوپلاسما ايمي تانس* نيز عفونت ناشي ازويروسIB را تشديد مي‌كنند. تلقيح داخل بيني سويه‌هاي مختلف ويروس IB و باکتری ا.كولاي، باعث بروز مرگ‌ومير در جوجه های جوان می شوند . در حالی که ؛ هيچ كدام از اين دو عامل به تنهايي كشنده نیستند. سويه‌هاي مختلف ويروس IB که حدت های متفاوتی دارند مرگ و میر 14 تا 82 درصد را در ماکیان ایجاد می کنند.در يك مطالعه تجربي، عفونت ويروس IB به همراه ا.كولاي، منجر به ايجاد آسيت در جوجه‌هاي گوشتي شد.
پاساژ ويروس IB در جنين جوجه‌ها منجر به كاهش حدت ويروس مي‌شود. سويه "بيوديت" که به تخم‌مرغ جنین دار سازگار یافته است، بيماريزا نبوده و ضايعه مشخصی را دراپي تليوم مژه‌دار ناي به وجود نمي‌آورد و عمدتاً درسلولهاي تحت اپي تليومي تكثير می شود.
در صورت پاساژهاي متوالي(13 پاساژ) سروتيپ كانكتيكوت در كلواك پرنده، تمايل بافتي آن از سيستم تنفسي به بافت كليوي تغييرمی یابد. ويروس IB در كليه و دیگر ارگانهاي غيرتنفسي حضور داشته و در ترشحات بيني‌و مدفوع وارد مي‌شوند.
سويه‌هاي مختلف ويروس IB در مجراي توليد مثلي پرنده ها، بیماریزایی متفاوتی دارند. وجود آنتي بادي مادري باعث می شود ويروس IB در اویداکت جوجه‌های یکروزه ضایعه ای ایجاد نکند .
در مرغان تخم‌گذار ، رنگ پوسته تخم مرغ تغيير یافته و كاهش توليد10الی 50 درصدي به وجود مي‌آورند و گاه ممکن است میزان تولید تخم مرغ کاهش نیابد .
در سال 91-1990 ميلادي در بريتانيا، سروتيپ جديد (B/793) با بیماریزایی غیرمعمول مشاهده شد. در مرغهاي مادر عضلات عمقي سينه رنگ پريده و متورم بوده ، دچار خونريزي سطحي شده و لايه‌اي از ادم ژلاتيني سطح عضله را پوشانده بود و هر دو عضله سطحي و عمقي سينه دچار ميوپاتي دو طرفه بودند.
در سال 1996.م شيوع تیپ پيش معده‌اي ويروس IB با علایم تورم پيش معده، زخم همراه با خونريزي و مرگ‌ومير 15الی80 درصدی در جوجه‌هاي گوشتي مشاهده شد. در پرنده های بیمار دپرسيون، چشمهاي متورم همراه با ريزش اشك، اسهال و متعاقب آن‌علايم واضح تنفسي وجود دارد. میزان واگیری بيماري 100درصد و مرگ‌ومير 20 درصد است. در كالبدگشايي پرنده های تلف شده ،تورم پيش معده غده‌اي مشاهده مي‌شود. از نمونه های گرفته شده ويروس IB جدا شده ویکی از‌جدايه‌ها QX IBV نامگذاري شد.
اعتقاد بر این است که كروناويروسهاي جدا شده از قرقاولها با بيماری‌هاي تنفسي و كليوی این پرنده ها مرتبط هستند.كروناويروسهاي بوقلمونها با بيماريهاي گوارشي همراه هستند.
بيماريزايي و همه‌گير شناسي
ميزبانهاي طبيعي و تجربي
نژادها و سويه‌هاي مختلف پرندگان حساسيت متفاوتی در برابر بيماري دارند و ماكيان تنها پرندگاني هستند كه به صورت طبيعي توسط ويروس IB آلوده و بيمار مي‌شوند. كروناويروسها از قرقاولهايي دچار بيماريهاي كليوي و تنفسي جدا شده و تعیین ترادف ژن مربوط به پروتئين S اين ويروسها نشان داد كه از لحاظ ژنومي بسيار شبيه‌ويروس IB هستند. تعیین ترادف ژنومي جدايه‌هاي مربوط به بوقلمونها نشان داد که نظیر ويروسهاي IB با همديگر متفاوتند.
درسرم گرفته شده از قرقاولها، تيتر HI مربوط به سويه M41 ويروس IB، كمتر از 1/16 بود، احتمالاً جدايه‌هاي مربوط به قرقاولها با توجه به محدوده‌ميزباني، متفاوت از ويروس IB هستند.قرقاولهاي Ring-necked و سارها در برابر تلقيح داخل بيني ويروس IB مقاوم هستند.
ويروس IB به بوقلمونها از طریق آيروسل تلقیح گردید و هيچ نوع علایم باليني مشاهده نشد.اما؛ در تلقيح داخل وريدي ویروس، ويرمي به مدت زمان 48 ساعت ایجاد شد. به طور مشابهی كروناويروس بوقلمونها به ماکیان تلقیح شد ، ويروس دربافتهاي گوارشي پرنده های تلقیح شده تكثير یافت. ولي؛ علايم باليني بيماري دیده نشد.
ماکیان در هر سنی نسبت به بيماري حساس هستند. ولي؛ بيماري در جوجه‌های جوانتر شديدتر بوده و با مرگ ومیر بيشتري همراه است.ماکیان با افزايش سن، دربرابر ضايعات كليوي و اويداكت و مرگ‌ومير ناشي از بيماري مقاومتر مي‌شوند.
انتقال، حامل‌ها و ناقل‌ها:
ويروس برونشيت عفوني سرعت انتشار بالایی دارد.پرنده‌هاي حساسي كه در مجاورت پرنده‌هاي بيمار قرار دارند، علايم بيماري را در عرض 48 ساعت نشان مي‌دهند.
در صورت مواجهه ماکیان با ویروس IB از طریق آیروسل ،ويروس از ناي، ريه، كليه و بورس جوجه‌ها در طی 1 تا 7 روز بعدی به طور مداوم جدا مي‌شود ؛ ميزان جداسازي ويروس باگذشت زمان بسته به سويه ويروس كاهش مي‌يابد.ويروس IB از تانسيلهاي سكومي 14 هفته و از مدفوع 20 هفته پس از آلودگي جدا شده است. دفع‌دوبارة ويروس در مرغهايي كه چندين هفته پس از تلقيح ويروس منفي بوده‌اند ، مشاهده شده است. ويروس از سواپ‌هاي كلواكي و نايي مرغها در شروع تخم‌گذاري و در سن نوزده هفتگي جدا شده است.
چگونگی حضور دائمي ويروس IB ناشناخته است و كليه يكي از مكانهایي است که ویروس حضور دارد. حضور ويروس واكسن IB به مدّت بيشتر از 163 روز ، در ارگانهاي داخلي مشاهده شده است. در طي اين مدّت ممكن است ويروس در ترشحات بيني و مدفوع نیز وارد شود.
چهل وسه روز پس از بهبودي گله مبتلا به IB ، ويروس از تخم‌مرغها جدا شده است. جوجه‌هاي متعلق به گله آلوده، هچ شده و عاري از ويروس IB پرورش می یابند.
ميزان انتشار بيماري از طريق هوا نامعلوم است و ناقل ها در انتشار ويروس IB نقشي ندارند.
دوره كمون:
دوره كمون IB بسته به‌میزان ويروس و روش تلقيح 18 الی 36 ساعت است . پخش طبيعي ویروس بیشتر از 36 ساعت طول می کشد.
علايم
علايم مشخصة تنفسي در ماکیان بلع هوا، سرفه، رال هاي نايي و ترشحات بيني مي‌باشد. چشمهاي مرطوب ، سينوسهاي متورم ، دپرسیون،کاهش مصرف غذا و کاهش وزن دیده می شود و جوجه ها زير يك منبع گرمایي كنار هم جمع می شوند. ، علايم بيماري قابل مشاهده در ماکیان بزرگتر از شش هفته و پرنده‌هاي بالغ ، مشابه علایم مشاهده شده در جوجه‌هاست اما ترشحات بینی، کمتر دیده شده ودر صورت عدم معاینه دقیق گله و عدم مشاهده گله در تاريكي شب(كه همه پرنده‌ها به صورت طبيعي ساكت‌اند) بيماري تشخيص داده نمی شود.
در صورت درگیری جوجه‌هاي گوشتي با ويروسهای نفروپاتوژن، علايم تنفسي بيماري ممکن است رفع شود ولي؛ پس از آن دپرسيون، ژوليدگي پرها، مرطوب شدن مدفوع و افزايش مصرف آب مشاهده می شود.
در گله‌هاي تخم‌گذار علايم تنفسي ،كاهش ميزان توليد و كاهش كيفيت تخم‌مرغ دیده می شود. در گله‌هايي كه میزان توليدشان کاهش مختصری داشته ، پوسته تخم‌مرغهای تولید شده رنگ پریده بوده و فاقد علايم تنفسي بودند، ويروس IB از سواپ‌هاي كلواكي و نمونه تانسيلهاي سكومي جدا شده است.ميزان كاهش تولید بسته به دوره تخم‌گذاري و سويه ويروسIB فرق مي‌كند. 6 الی 8 هفته طول مي‌كشد تا توليد تخم مرغ به حالت عادی باز گردد و در اكثر مواقع، تولید تخم مرغ به ميزان توليد قبلي برنمی گردد. ؛ ميزان جوجه درآوری كاهش می یابد. تعداد تخم‌مرغهاي پوسته‌نرم، بدشكل و پوسته زبر افزايش یافته و تعداد تخم‌مرغهاي ارسالی به جوجه کشی کاهش می یابد.كيفيت داخلي تخم‌مرغها ممكن است كاهش یابد. آلبومین نازك و آبكي شده و مرز مشخصي میان دو بخش ضخيم و نازك آن وجود ندارد. در مرغهاي تخم‌گذار در صورت همراه شدن سنگ كليه با بیماری IB ، تلفات كلي گله افزايش می یابد. ولي؛ گله ممکن است نرمال به نظر برسد.
در صورت درگيري جوجه‌هاي يكروزه با ويروس IB ، اويداكت،دچار ضايعه دائمي شده و در دوره تخم گذاری جوجه های مزبور،كاهش توليد و کاهش كيفيت تخم‌مرغ دیده می شود. آنتي بادي‌هاي مادري در سنين اوليه جوجه‌ها ،از ايجاد ضايعه ويروس IB در اويداكت جوجه ها، جلوگيري مي‌كنند.
در یک مطالعه، آلودگی قرقاولهاي تخم‌گذار با كروناويروسها منجر به كاهش جوجه درآوری،كوچك شدن اندازه و رنگ پریدگی تخم مرغهای توليدي شد. در یک فارم قرقاول که 15 درصد قرقاولهاي بالغ سريعاً تلف شدند و تنها علامت بالینی قابل مشاهده عطسه بود ، كروناويروس جدا شد . در این گله ميزان توليد تخم و جوجه درآوری، كاهش يافته ولي كيفيت‌تخم هاي توليدي تغييري نيافته بود.
شيوع و مرگ‌ومير:
میزان واگیری بیماری ممکن است به 100 درصد گله مبتلا برسد؛ ميزان‌مرگ‌ومير ایجاد شده به "حدت ویروس، سن پرنده، وضعيت ايمني مادري،وضعیت ايمني فعال پرنده‌ها و وجود استرس‌هايي نظير سرما و يا عفونت های ثانويه باكتريايي بستگی دارد.
جنسيت، نژاد و تغذيه شدت بيماريهاي كليوي را تحت تاثیر قرار مي‌دهند. مرگ‌ومير در جوجه‌هاي زير 6 هفته به میزان 25 درصدو يا بيشتر بوده و در جوجه‌هاي بالاي شش هفته قابل توجه نیست، میزان مرگ‌ومير گله‌هاي دچار سنگ كليوي 1-0.5 درصد در هفته مي‌باشد.
در چين در تیپ پيش معده‌اي بیماری در جوجه‌هاي گوشتي، مرگ‌ومير 80-15درصدی مشاهده شده و مرگ‌ومير 45 درصدی در يك فارم زينتي قرقاول با سن ده هفته گزارش شده است.
جراحات كالبدگشايي:
ترشحات سروزي، نزله ای و یا پنیري در ناي، بيني وسينوس پرنده های مبتلا وجود دارد. كيسه‌هاي هوايي کدر شده و ترشحات اگزودايي پنيري زرد رنگ در داخل‌شان دیده می شود. پلاکهاي پنيري در بخش پاييني ناي و برونش جوجه‌های تلف شده و نقاط كوچك پنوموني دراطراف برونشهاي بزرگ ديده می شود.
در صورت درگیری کلیه ها، تورم كليه و رنگ پريدگی آن و پر شدن توبولها و حالبها با اورات مشاهده می شود.
در محوطه شكمي پرنده هاي در حال توليد محتویات زرده آبكي ديده می شود، اين حالت در بيماريهاي ديگري نیز(كه به صورت مشخصي موجب كاهش توليد تخم‌مرغ مي‌شوند) ديده مي‌شود.
در صورت آلودگي جوجه‌هاي يكروزه با ويروس IB ، يك سوم مياني اويداكت ممکن است دچار ضايعه دائمي شده ، بخوبی رشد نكرده و غدد كمي داشته باشد و کاهش تولید در دوره تخم گذاری پرنده های مبتلا مشاهده شود.
در قرقاولهاي آلوده به كروناويروسها نقرس احشایی، سنگ كليه ، تورم واضح و رنگ پريدگی كليه‌ها بیشتر از بقیه ضایعات مشاهده می شود.
هيستو پاتولوژي:
مخاط ناي جوجه‌هاي درگير با IB، ادماتوز است. در طي 18 ساعت پس از آلودگی از دست رفتن مژكها، گردشدن و كنده شدن سلولهاي اپي تليومي و نفوذ كم هتروفيلها و لنفوسيتها ديده می شود و بازسازي اپي تليوم نای پس از 48 ساعت شروع مي‌شود.
پس از 7 روز هيپرپلازي به همراه نفوذ وسيع سلولهاي لنفوئيدي در لايه لامينا پروپريا و تشكيل تعداد زيادي مراكز زايا ديده مي‌شود. در صورت درگيري كيسه‌هاي هوايي، ادم، تغيير شكل سلولهای اپي تليومي و اگزوداي فيبریني در عرض 24 ساعت دیده می شود.
نفريت بينابيني عمده ترین ضايعه كليوي مشاهده شده دربیماری IB مي‌باشد. در مراحل حاد بیماری، دژنراسيون گرانولي، واكوئله شدن و تغيير شكل اپي تليوم توبولها و نفوذ وسيع هتروفیلها در بافت بينابيني دیده مي‌شود. ضايعات توبولي بيشتر دربخش مدولای آن است. در طي مراحل التيامي،جمعيت سلولهاي التهابي به لنفوسيتها و پلاسماسلها تغيير پيدا مي‌كند. تغييرات دژنراتیو ممكن‌است باقي مانده و باعث آتروفي شديد يك يا همة قسمتهاي نفرونها شود. درصورت وجود سنگ كليه، حالبها بااورات انباشته شده ، اغلب واجد سنگ از جنس اورات بوده و كليه‌ها آتروفي مي شوند.
با استفاده از میکروسكوپ الكتروني، معلوم شده است كه‌سلولهاي اپي تلیومي نفرونها و مجاري پايين تر، اهداف اوليه تكثير ويروس IB هستند. ذرات ويروسي در سلولهاي اپي تليومي مجاري و توبولهاي جمع‌كننده، توبولهاي خلفي و لوپ هنله بيشتر از توبولهاي قدامي ديده مي‌شوند. در سيتوپلاسم سلولهای اپی تلیومی آلوده به ویروس، تورم میتوکندریها،بزرگ شدن وزیکولهای گلژی و افزایش مقدار رتیکولوم اندوپلاسميك خشن (RER) دیده مي‌شود.
درآلودگي تجربي اويداكت مرغهاي بالغ با ويروس IB، كاهش ارتفاع و از دست رفتن مژك سلولهاي اپيتليومي، اتساع غدد توبولي، نفوذ لنفوسيتها، پلاسماسلها ، هتروفيلها و ديگر سلولهاي تك هسته‌اي، ، ادم و فیبروپلازي مخاط تمامی قسمتهاي اويداكت مشاهده مي‌شود.
در پولت قرقاولهای آلوده به كروناويروس ها، نفريت بينابيني نسبتاً شديد كليه ها ديده می شود.نفوذ سلولهاي تك هسته‌اي ، اتساع، و پهن شدن اپي تليوم داخل توبولها و تشكيل كیست و نكروز موضعي ديده مي‌شود.
ايمني:
ايمني فعال:
در ماکیان، مقاومت ژنتيكي وابسته به نژاد و سويه دربرابر بیماری IB مشاهده می شود. جوجه‌هايي كه از بيماري طبيعي بهبود مي يابند نسبت به مواجهه با ويروس مشابه(محافظت همولوگ) مقاوم هستند اما؛ميزان‌مقاومت در برابر ديگر سويه‌هاي ويروس IB (محافظت هترولوگ) متفاوت است. محافظت تنفسي 3الی4 هفته پس از آلودگي با ويروس IB و یا واکسیناسیون ایجاد مي‌شود. روشهاي مواجهه با ويروس به صورت نايي،داخل بيني و يا قطرة چشمي است.عدم جداسازي ويروس از ناي، پس از گذشت 5-4 روز، نمایانگر ايجاد ايمني است. شواهد ديگر ايجاد ايمني، عدم‌جداسازي ويروس از كليه و اويداكت، نبود علايم باليني بيماري IB، نبود جراحات نايي ويا فعاليت طبیعی مژكهاي ناي مي‌باشد.روش ديگر، ارزيابي میزان مرگ و میر جوجه‌هاي واكسينه شده در برابر مواجهه باويروس IB و باكتري اكولاي مي‌باشد. درصورت وجود نفریت، محافظت در برابر مرگ‌ومير ناشي از آن، شاهدي بر ايمني رضايت بخش حاصله از واكسيناسيون می باشد.
كاهش افت تولید و يا ممانعت کامل از افت توليد تخم مرغ در مواقع مواجهه با ويروس IB ، شاهدي بر وجود ايمني در مرغهاي تخم‌گذار مي‌باشد.
گليكوپپتید 1S پاسخگوي ايجاد آنتيباديهاي VN و HI بوده و نقش عمده‌اي درايجاد ايمني محافظت بخش دارد. اطلاعات موجود در مورد مكانيسم محافظت در برابر بيماري باليني و همچنین نقش آنتي‌باديهای موضعي در پيشگيري از عفونتها واضح نیست؛ آنتيباديهاي خنثي‌كننده موجود در ترشحات بيني در پيشگيري از آلودگي دوباره نقش داشته و غده هاردرين نيز در ايمني موضعي نقش دارد. ميزان آنتي بادي موجود در اشك پرنده‌ها بیانگر میزان دقيق ايمني موجود در برابر IB نبوده و آنتي‌باديها تنها منبع مقاومت در برابر بيماري IB نيستند. بروز بیماری IB در جوجه‌های دچار بيماري بورس عفوني(IBD) در مقايسه با جوجه‌هاي غير درگير شديدتر است.
فعاليت لنفوسيت های سيتوتوكسيك و سلولهاي كشندة طبيعي (NK سل‌ها)، نفوذ وسيع سلولهاي T (بخصوص +4CDها) در بافتهاي تنفسي و بقیه بافتهای درگیر جوجه‌هاي آلوده‌به ويروس IB بیانگر وجود پاسخهاي ايمني با واسطه سلولي در برابر بیماری هستند.
ده روز پس از آلودگي با ويروس IB ، پاسخ لنفوسيت های T سيتوتوكسيك به‌حداكثر خود رسيده و با كاهش تعداد ويروسهای IB در ريه‌ها و كليه‌ها مطابقت دارد. اينترفرون نقش شناخته شده ای جهت ايجاد مقاومت در برابر بيماري ندارد.
ايمني غيرفعّال:
درصورتی که ويروس واكسن استفاده شده در جوجه های گوشتی، مشابه ويروس واکسن استفاده شده در گله‌هاي مادرباشد ، آنتي‌بادي های مادري، اثر بخشي واكسن استفاده شده در جوجه های گوشتی و واكنشهای پس از آن را كاهش می دهند با اینحال، واكسيناسيون جوجه‌هاي تجاري يكروزة که واجد ايمني مادري هستند، به صورت معمول انجام مي‌شود.
در یک مطالعه، آنتي‌بادیهاي مادري در سن يك روزگي و يك هفتگي ،در برابر مواجهه باویروس بیماریزای IB ايمني ایجاد کردند ولي؛ در دوهفتگي قادر به ایجاد ایمنی نبودند.طی مطالعه دیگری جوجه‌هاي یکروزه ای که ايمني مادري بالایی داشتند، محافظت بالاي 95درصد در برابر مواجهه با عامل بيماريزا داشتند در حالیکه در هفت روزگي اين ميزان به 30درصد رسيد. محافظت ایجاد شده به ميزان آنتي بادي موضعي سيستم تنفسي بستگی داشته و به‌آنتي بادي سرمي ارتباطي ندارد. جوجه‌هاي دارای آنتي بادي مادري در مقايسه با جوجه‌هاي فاقد آنتي‌بادي مادري، دربرابر واكسيناسيون دوم IBV پاسخ آنتي‌بادي خنثي‌كنندة كمتري دارند، همچنين ميزان تيتر آنتي بادی مادري جوجه‌هایی که در سن يكروزگي واکسینه شده بودند در مقايسه با گروه غیرواکسینه ، كاهش سريعتري داشت.
تشخيص:
تشخيص برونشيت عفوني براساس تاريخچه باليني، جراحات‌بیماری، تغييرو يا افزايش آنتيباديهاي سرمي، شناسايي آنتي‌ژن ويروس IB با استفاده از روشهاي مبتني بر آنتي‌بادي، جداسازي ويروس و شناسايي RNA ويروسي صورت مي‌گيرد.
در تشخيص این بیماری ، در صورت امكان به علّت تغييرات آنتي‌ژنيكي بسيار زياد سويه‌هاي ويروس برونشيت عفوني وهمچنين وجود واكسن هاي تهيه شده از سروتيپ‌هاي مختلف ويروس IB، ژنوتيپ و سروتيپ ويروس نيز بايستي شناسايي شوند.
به هرحال هيچ نوع تكنيكي به تنهايي (براساس آنتي‌بادي و يا تكنولوژي‌اسيد نوكلئيك) جهت تأييد آلودگي با يك سروتيپ اختصاصي ويروس برونشيت عفوني كافي نمي‌باشد.
تشخيص و جداسازي عامل موجد بيماري
جداسازي ويروس:
ناي اولين و بهترين مکان نمونه‌برداري، به خصوص در طي هفتة اول پس از آلودگي مي‌باشد، تيتر ويروس ، در روز پنجم پس از آلودگی در حداكثر خود بوده و پس از آن بسرعت كاهش مي‌يابد، يك هفته پس از شروع آلودگي، سواپ‌هاي كلواكي و يا تانسيلهاي سكومي(كه بعد از مرگ پرنده‌ها جمع‌آوري مي‌شوند) جهت جداسازی ویروس استفاده می شوند، ويروس‌ابتدا در مناطق فوقاني مجراي تنفسي رشد كرده و سپس به ارگانهاي غيرتنفسي انتشارمي‌يابد و از ناي زودتر از بافتهاي گوارشي پاك مي‌شود.شواهدي مبني بر وجود ويروس IB، در بافتهاي غيرتنفسي نیز وجوددارد.نمونه گیری از ریه،کلیه و اویداکت بر اساس تاریخچه علایم بالینی بیماری صورت می گیرد.
نمونه‌گيري از فارمهاي بزرگ مشکل است، در صورت منفی بودن نمونه‌گيري مستقيم ،پرنده های حساس در داخل گله قرار داده شده ، پس از یک هفته بیرون آورده شده و از این پرنده ها نمونه گیری می شود، نمونه های گرفته شده بداخل تخم مرغ های جنین دار ماکیان و یا کشت سلولی نای (TOC) تلقیح می شود،پس از 72- 48 ساعت مایع تخم مرغها جهت پاساژ کور در محیط کشت های دیگر برداشت می شود. هر نمونه، قبل از اين كه منفي تلقي شود، حداقل چهاربار پاساژ كور داده می شود و حضور ويروس با استفاده از الايزا،ايمنوهيستوشيمي، آناليز اسيد نوكلئيك و يا ميكروسكوپ الكتروني تأييد می شود. جوجه‌هاي حساس از طریق داخل نايي و با استفاده از نمونه‌هاي اصلي و يامايع كشتي پاساژ اول تلقيح می شوند، در صورت وجود ویروس IB، علائم تنفسي تيپيك در عرض 36-18 ساعت ایجاد می شود. چهار هفته پس از تلقيح، آنتي سرم ويروس، جهت تعيين سروتيپ جدايه (آزمايش VN) جمع‌آوري می شود. جهت جداسازی ویروس در قرقاولها ،از بافتهاي تنفسي ،كليوي و دهان نمونه گیری می شود و نمونه های ويروسی در كيسة آلانتوئيك تخم‌مرغ ماكيان اهلي تلقيح می شود.
كروناويروسهاي شناخته شدة بوقلمونها دربافتهاي گوارشي و بورس فابرسيوس رشدمی کنند ، نمونه‌هاي گرفته شده از اين بافتها به كيسة‌آمونيوتيك تخم‌هاي جنين‌دار بوقلمونها تلقيح مي‌شود.
«تأييد ويروس IB با استفاده از روشهاي مبتني بر آنتي‌بادي»:
شناسايي ويروس IB، در نمونه‌گيري های صورت گرفته از لاشه نیز مي‌تواند صورت گيرد، قسمتهايي از ناي يا مخاط آن و ديگر بافتهای پرنده تلف شده، گرفته‌شده و آزمايشهاي ايمنوفلورسانس ویا ايمنوپراكسيداز با استفاده از آنتيباديهاي مونوكلونال وپلي كلونال اختصاصي ويروس IB انجام مي‌شود. آزمايش AGPT نيز برروي نمونه‌هاي ناي انجام می شود و حساسيت آن بيشتر از اندازه‌اي است كه انتظار مي‌رود. درصورت تكثير ويروس در تخم‌مرغ هاي جنين‌دار؛ تأييدحضور ويروس IB با آزمايش AGPT می تواند انجام شود. ويروس برونشيت عفوني درمايع آلانتوئيك و يا پس از رشد در كشت بافتي ناي، با استفاده از آنتيباديهاي مونوكلونال و الايزاي مستقيم يا غيرمستقيم تا حد سروتيپ شناسايي می شود.
واکنشهای متقاطع مابین کروناویروس های بوقلمون ها وIBV مشاهده شده و الیزا جهت شناسایی آنتی بادی کروناویروس ها در سرم بوقلمون ها استفاده شده است.
كروناويروس هاي جدا شده از قرقاولها در آزمايشهاي VN و HI كه سرم ضدسروتيپ‌هاي ويروس IB را استفاده مي‌كنند، به طور ضعيفي واكنش متقاطع نشان داده‌اند.
«تأييد ويروس برونشيت عفوني با استفاده از روشهاي مبتني بر اسيد نوكلئيك:
آزمايش RT-PCR، بر روي نمونه‌های مستقيم گرفته شده از جوجه‌هاي آلوده و يا پس از تكثير ابتدايي ويروس در تخم‌مرغهاي جنين‌دار، انجام می شود.
محققي PCR چهل سيكلي را براي شناسايي ژن پروتئين N ويروس IB موجود درترشحات ناي جوجه‌های آلوده با ويروس IB استفاده نمود، ويروس IB در 100-75 درصد نمونه‌هاي نايي جمع‌آوري شده در روز سوم پس از تلقيح شناسايي شد؛ اين ميزان بيشتر از اندازه ای است كه توسط رنگ‌آميزي ايمنوپروكسيداز بافت نايي به دست مي‌آيد. آزمايش RT-PCR كه بر روي بخشي از ژن 1S انجام گرفت؛ محصولات تقريباً bp480 را ایجاد نمود و ويروس در 75 درصد نمونه ها شناسایی شد.
محققی جوجه ها را با سویه های 41-M و آرکانزاس آلوده نمود ودر نمونه های ویروسی صورت گرفته ، بخش S1 ژن پروتئین S را با استفاده از RT-PCR تکثیر نمود.اما؛ قادر به شناسایی سویه M-41 نشد. سوية آركانزاس در روزهاي سوم، چهارم وپنجم پس از تلقيح شناسايي شد .ولی؛ در روزهاي قبل و پس از آن شناسايي نشد.
Nested-PCR حساستر از PCR تكي مي‌باشد. Nested-PCR جهت تكثير بخشي از ژن پروتئين 1S، RNA استخراج شده از سواپ‌هاي نايي استفاده شد. حساسيت اضافي Nested-PCR شناسايي عفونتهاي ضعيف IB را نيز امكان‌پذير می سازد ولی به هر حال بسيار حساستر از آن است كه براي تشخيص معمول استفاده شود. مقادير بسيار كم از DNAهاي آلوده‌كننده ممكن است تكثيریافته و جواب مثبت كاذب بدهد. ژنوتيپ ويروس IB با استفاده ازاليگونوكلئوتيدهاي اختصاصي ژنوتيپ و يا سكوئنس محصول PCR شناسايي می شود. درصورت استفاده از تعیین ترادف ژنومی، اليگونوكلئوتيدي‌هاي جهاني بايد استفاده شود. در چنين حالتي تيپ‌هاي جديد ويروس IB ممكن است مورد شناسايي قرار نگيرد. بهتر است دواستراتژي جهت تحقيقات بيشتر مدنظر قرار گيرد: يك روش، انجام PCR-RT بر رويRNA استخراج شده از ناي و يا از سواپ‌ها است كه تا حد امكان بيشترين مقدارRNA، استفاده شده و همة محصول RT در PCR به کار می رود و نسبتاً محصول DNA كوچكي به وجود مي‌آيد.در حالت دوم ابتدا ويروس گرفته شده از ناي و از سواپ‌ها درتخم‌مرغهاي جنين‌دار تكثير مي‌شود؛ يك يا دو پاساژ بیست وچهار ساعته منجر به توليد ويروس فيلدي كافي در مايع آلانتوئيك شده كه جهت شناسايي بعدي توسط RT-PCR استفاده مي‌شود و محصول bp1020 ايجاد مي‌شود. وقتي كه محصول PCR نسبتاًبزرگي مورد نياز است؛ ويروس IB قبل از RT-PCR در تخم‌مرغ رشد داده مي‌شود. ميزان بالاي شباهت ژنومي كروناويروسهاي بوقلمونها و قرقاولها با ويروس IB به این معني است كه اين ويروسها احتمالاً مي‌توانند با استفاده از اليگونوكلئوتيدهای جهاني طراحي‌شده براي ويروس IB شناسايي شوند.
روشهاي مبتني بر اسيدنوكلئيك براي توصيف حضور كروناويروسها در بوقلمونها به طور وسيع و موفقيت‌آميزي به کار می روند.
«سرولوژي»:
وجود سروتیپ های مختلف و همچنین تفاوتهای آنتی ژنیکی موجود مابین تیپ های مختلف ویروس IB، انتخاب روش سرولوژیکی مناسب و تحلیل نتایج آزمایشهای انجام گرفته را دچار مشکل می کند.
سروتيپ‌هاي مختلف ويروس IB، اپي‌توپ‌هاي مشتركي دارند(آنتي‌ژنهاي اختصاصي گروه) كه اين امر موجب شناسايي سكوئنس اسيدآمينه‌ايي بالايي در بين پروتئين هاي N,M و بخش 2S پروتئين S مي‌شود. ويروس IB همچنين آنتي‌بادي هاي اختصاصي سروتيپ را با استفاده از اپي‌توپ‌هاي پروتئين 1S ایجاد می کند.
در آزمايشهاي الايزا، ايمنوفلورسانس و ايمنوديفيوژن، آنتي‌بادي به هر دوی آنتي‌ژنهاي اختصاصي‌گروه وسرو‌تيپ باند مي‌شود، به خاطر اين خصوصيت باندي دوگانه، تيپ‌های مختلف ويروس IB با استفاده از اين تست‌ها شناسايي نمي‌شوند. بيشتر پاسخهاي اوليه آنتي بادي در برابر ويروس IB ، نسبت به تيپ ويروس اختصاصي هستند و تيپ‌هاي مختلف ويروس IB بااستفاده ازآزمايش‌هاي VN و HI تفريق می شوند.
پاسخهاي ثانويه سرمی در برابر ويروس IB، حتي در آزمايشهاي HI و VN به صورت وسيعي واكنش‌پذير هستند، درصورت وجود واكنشهاي متقاطع، شناسايي سوية آلوده‌كننده با استفاده از سرولوژي امكان‌پذير نيست و در چنين نمونه‌هايي قدرت تمايزپذيري آزمايشهاي VN و يا HI بهتر از تست هاي ديگر نمي‌باشد.
آزمایشهای سرولوژيک معمول به صورت معمول با استفاده ازآزمايش‌هاي VN،HI و يا الايزا انجام مي‌شوند.
آزمايش AGPT نسبت به گروه اختصاصي بوده، ولي؛ آنتيباديهاي خنثي‌كننده در آن عمر كمي دارند. نتيجة مثبت AGPT بيانگر عفونت قبلي مي‌باشد.بهر حال AGPT جهت شناسايي آنتيباديهاي ويروس IB توصيه‌نشده و بهتر است با آزمایش AGPT آنتي‌ژنهاي ويروس IB مورد بررسي قرار گيرند.
الايزا نسبت به گروه اختصاصي بوده، به صورت وسيع استفاده شده و كيت‌هاي آن به صورت‌تجاري در دسترس است. الايزا آنتيباديهاي ويروس IB را در عرض يك هفته پس از آلودگي شناسايي مي‌كند و اين زودتر از زماني است كه آنتی بادیها توسط آزمايشهاي VN و HI شناسايي مي‌شوند. دو نمونه سرمي جهت اين آزمايش لازم است: نمونه گیری اول، در بروزنخستين علائم آلودگي گرفته مي‌شود و نمونة دوم، يك هفته يا بيشتر از آن پس ازشروع بيماري اخذ مي‌شود. تأخير در گرفتن نمونة اوّل مانع از شناسايي تغيير سرمي می شود.
Igm بلافاصله پس از آلودگي با ويروس IB ايجاد شده و موقتي است، بنابراين شناسايي Igm اختصاصي ويروس IB بيانگر عفونت قبلي مي‌باشد.
هزينة پايين، تجهيزات سادة موردنياز و سرعت انجام آزمايش HI، آن را روشی بسیار سودمند جهت تشخيص معمول بيماري IB قرار مي‌دهد. آزمايشهاي VN و HI براي شناسايي آنتيباديهاي ويروس IB، نسبت به تيپ ويروس‌اختصاصي بوده، هر چند كه واكنش متقاطع به خصوص در آزمايش HI، در بين‌سروتيپ‌ها مشاهده می شود. اين مسأله HI را به عنوان آزمايشي جهت پايش پاسخ واكسيناسيون زير سؤال مي‌برد. در گلة های گوشتي كه، دچار مواجهة فيلدي يا تجربي با ويروس IB بوده و قبلاً بر عليه بيماري IB واكسن تجویز شده‌است واكنشهاي متقاطع‌سرمی دیده می شود. الايزاي رقابتي و يا الايزاي غيرمستقيم مبتني بر آنتيباديهاي مونوكلونال جهت شناسايي آنتي‌باديها بر عليه سروتيپ‌هاي ماساچوست آمريكاي‌شمالي و آركانزاس (در سرم جوجه‌هايي كه به صورت سرمي تلقيح شده‌اند) استفاده شده‌است. اختصاصيت الايزاي بلوك‌كننده، به خوبي با ميزان اختصاصيت آزمايش VN، قابل‌مقايسه است.
«تشخيص تفريقي»:
علائم بيماري برونشيت عفوني مشابه سایر بيماريهاي حاد سیستم تنفسي نظير نيوكاسل، لارنگوتراكئيت و كريزاي عفوني است. علایم بالینی بيماري نيوكاسل به صورت معمول بسيار شديدتر از برونشيت است. علائم عصبي همراه باسويه‌هاي حاد بيماري نيوكاسل ديده شده و كاهش توليد ایجاد شده درگله‌هاي تخم‌گذار بيشتر از بيماري برونشيت است. بيماري‌لارنگوتراكئيت با سرعت كمي در داخل گله شيوع پيدا كرده، اما؛ علائم باليني، ممكن‌است بسيار شديدتر از بيماري برونشيت باشد.
بيماري كريزا براساس تورم صورت که به ندرت در بيماري برونشيت دیده می شود؛ تفريق‌مي گردد. در بيماري سندرم كاهش تخم‌مرغ (EDS) ميزان توليد كاهش يافته و كيفيت پوسته دچار مشكل مي‌شود. اين علائم مشابه علائمي است كه در بيماري برونشيت‌ديده مي‌شود. با اين تفاوت كه كيفيت داخلي تخم‌مرغ در EDS تغيير نمي‌كند.
«استراتژي‌هاي مداخله‌اي»
برخوردهاي مديريتي:
متعاقب آماده سازي و ضدعفوني مزرعه، قرنطينة شديد و جوجه‌ريزي تازه باجوجه‌هاي يكروزه بايستي انجام گيرد، وجود گله‌هاي چند سني در يك فارم با تراكم بالا، كنترل بيماري را بسيار مشكل مي‌كند و استفاده از واکسن جهت پيشگيري ازكاهش توليد در اثر IB ضروری است ، واکسیناسیون در گله‌هاي تك سني نيز صورت گرفته و از كاهش شديد ميزان توليد در اثر ويروس IB در گله‌هاي حساس در طي‌سيكل تخم‌گذاري پيشگيري می کند.
«واكسيناسيون»
واكسنهای زنده و كشته در ایجاد ایمنی برعلیه IB استفاده مي‌شوند. واكسنهاي‌زنده در جوجه‌هاي گوشتي و براي واكسيناسيون ابتدايي مادرها و تخم‌گذارها استفاده‌مي‌شوند. واكسنهاي روغني كشته در گله‌هاي مادر و تخم‌گذار در ابتداي شروع تخم‌گذاري استفاده مي‌شود، سويه‌هاي ويروسی موجود درواكسن‌هاي زنده با استفاده از پاساژهای متوالي در تخم‌مرغهاي جنين‌دار جوجه‌ها تخفيف حدت يافته‌اند. پاساژ بيش از حد نبايستی باعث كاهش ايمنی زایی ويروسها شود. تعدادي ازواكسن‌ها پس از پاساژِ برعكس در جوجه‌ها، حدت شان افزايش يافته است، واكسنهاي سروتيپ ماساچوست به صورت معمول استفاده مي‌شوند. حدت ويروس‌ماساچوست موجود در واکسن می تواند افزايش يافته و قادر به شكستن پاسخهاي ايمني ناشي از واكسن باشد، سويه‌هاي واكسن انتخاب شده، طيف آنتي‌ژنيكي جدايه‌هاي موجود در يك كشور و يا منطقة خاص را نشان مي‌دهند. سويه M-41، ماساچوست،H120 و ديگر واكسنهاي سروتيپ ماساچوست به صورت وسيعي در سرتاسر دنيا استفاده مي‌شوند. چرا كه جدايه‌هاي اوليه تعدادي از كشورها از اين سروتيپ بوده‌اند. در آمريكا سويه‌هاي متعلق به سروتيپ‌هاي ماساچوست، كاناكتيكوت وآركانزاس به صورت وسيعي مورد استفاده قرار می گیرند. در حالي كه سروتيپ‌هاي ديگر نظيرDE-072 به صورت منطقه‌اي استفاده مي‌شوند. به علاوه واكسنهاي اتوژن كشته كه از جدايه‌هاي اختصاصي محلي تهيه شده‌اند، ممكن است جهت ایجاد ایمنی در گله‌هاي مادر و تخم‌گذار استفاده شوند.
در تعدادي از كشورهاي اروپايي سويه‌هاي D-274 ، D-1466 و 91/4 (b/793) نيز به غير از 120-H استفاده مي‌شوند، در استراليا سويه‌هاي تحت تيپ‌هاي B و C استفاده مي‌شوند. عليرغم استفاده از واكسن آركانزاس در يك منطقه، درگيري با ویروس های فیلدی این سویه ممكن است دیده شود. واكسن ويروس IB باتكثير پنوموويروسهاي پرنده‌اي تخفيف حدت يافته، تداخل ايجاد مي‌كند. هر چند مانع‌ايجاد پاسخهاي ايمني توسط پنوموويروس‌ها نمي‌شود. رشد بيش ازحد هر دوي سويه‌هاي فيلدي و واكسينال ويروس برونشيت احتمالاً اثربخشي پنوموويروس‌ها را در حالت فيلدي كاهش مي‌دهند.
روشهاي تلقيح
واكسن زندة تركيبي ويروسهای IB و ND، به صورت مرتب استفاده مي‌شود.درصورت بالا بودن ميزان ويروس IB، ممكن است با پاسخ در برابر ويروس ND تداخل‌ايجاد كند. هيچ تداخل مشابهي در مورد ويروس IB گزارش نشده است. تجويز تجربي واكسن زنده به صورت قطرة چشمي، داخل بيني و داخل نايي صورت می گيرد. تلقيح داخل جنيني نيز به صورت تجربي صورت گرفته است.
روشهاي تجويزكلي به صورت اسپري با قطرات درشت، آيروسل و آشاميدني مي‌باشد،این روشها به علت راحتي انجامشان مورد پسند عموم هستند. اما؛ مشكلاتي در تجويز يك شكل واكسن ديده می شود. در روش آيروسل واكنشهاي تنفسي بسيار شديدي می تواند ايجادشود. واكسن هايي كه به صورت آشاميدني تجويز مي‌شوند؛ دربرابر مواد ضدعفوني كننده( كه جهت كنترل آلودگی‌هاي باكتريايي و قارچي به سيستم‌آب‌رساني اضافه مي‌شوند) بسيار حساس مي‌باشند. حذف مواد ضد عفوني كنندة آب قبل از واكسيناسيون و اضافه كردن پودر شير بدون چربي با غلظت 400/1 باعث ثبات بيشتر تيتر ويروس در طي تجويز واكسن مي‌شود.
واكسنهاي كشته، نيازمند تجويز به تك تك پرندگان مي‌باشند. اين واكسن‌ها به‌صورت معمول پس از واكسيناسيون‌اوليه، با ويروس زنده تجويز شده و چند هفته قبل ازشروع توليد استفاده مي‌شوند اين واكسن‌ها ممكن است همراه با ديگر واكسنهاي كشته مورداستفاده قرار گیرند.
جوجه‌هاي گوشتي به صورت معمول با واكسن زندة IB در هچري و در سن يكروزگي واكسينه مي‌شوند، واكسن دوم با سروتيپ مشابه يا متفاوت در سن ده روزگي و يا پس از آن تجويز مي‌شود. واكسن اول مرغهاي مادر گوشتي و يا تخم‌گذار تجاري در فارم، در سن دو الی سه هفتگي تجويز مي‌شود، تعيين زمان واكسن اول بنا بر تيترآنتي‌بادي مادري و روش تجويز واكسن با یکديگر تفاوت دارد. برنامه‌هايي نظير واكسيناسيون هاي بعدي در 7 الی 12 و يا 16 الی 18 هفتگي و در نقطة شروع زمان تخم‌گذاري( بنا بر مديريت گله و وضعيت بيماري) صورت مي‌گيرد. در آمريكا تعدادي ازجوجه‌هاي تيپ تخم‌گذار با فاصله‌هاي زماني 8 الی 10هفته، در طي سيكل تخم‌گذاري با سوية M-41 و با روش آشاميدني و يا آيروسل واكسينه مي‌شوند.
درمان
هيچ درمان اختصاصي براي بيماري IB وجود ندارد. ولی؛ می توان از گرماي اضافي براي حذف استرس سرمايي، حذف تراكم اضافي ، تلاش براي مصرف غذا توسط پرنده‌ها جهت ممانعت از كاهش وزن، درمان با داروهاي ضدباكتريايي مناسب جهت كمك در كاهش ضايعات ناشي از تورم كيسه‌هاي هوايي استفاده کرد.
استفاده از جايگزين كننده الكتروليت‌ها كه در آب آشاميدني تجويز مي‌شوند؛توصيه شده و در استراليا اين مواد براي جبران از دست دادن حاد سديم و پتاسيم به کار رفته و ضايعات ناشي از نفريت را كاهش مي‌دهد. غلظت توصيه شده سديم وپتاسيم meq72 مي‌باشد. كه حدّاقل یک سوم در سيترات و يا نمك بي‌كربنات تجويز مي‌شود.
No comments:
Post a Comment