ازابتدای شناخت بيماري در سال 1924 ميلادي، بیماری با اسامی مختلفي نظيرلارنگوتراكئيت، لارنگوتراكئيت عفوني و ديفتري پرنده‌ها نامگذاری شده است. لارنگوتراكئيت اولين بيماري ويروسي مهم پرنده‌هاست كه واكسن مؤثر برای آن ساخته شده است. اما؛ هيچ شواهدي مبني بر انتقال ويروس ILT به انسانها و يا ديگر پستانداران وجود ندارد.
اتيولوژي
ويروس ILT عضوي از خانواده هرپس وريده[2] و تحت خانواده آلفاهرپس‌ويرينه[3] است و از لحاظ تاكسونومي به عنوان‌گاليدهرپس ويروس 1 [4] شناخته مي‌شود.
ويروس LT در زیر ميكروسكوپ الكتروني به صورت ذرات ويروس 20 وجهي ديده شده و شبيه ويروس هرپس‌سيمپلكس[5] مي‌باشد. نوكلئوكپسيد 6وجهي ویروس 100-80 نانومتر بوده، تقارن 20 وجهي داشته و مركب از162 كپسومر طولي توخالي مي‌باشد.
ذرات كامل ويروس به اندازه 250-195 نانومتر است و غشاي سطحي نامنظمي دارد كه نوكلئوكپسيدها را احاطه كرده است. برجستگي‌هاي گليكو پروتئيني ريزي در غشاي ويروس ديده مي‌شود.
ژنوم آن خطي (Kb -155) و دو رشته‌اي بوده و واجد دوفرم ايزومريك است و وزن مولكولي DNA ويروس تقريباً 610*100 است. ميزان G+C ژنوم ویروس 45درصد مي‌باشد كه كمتر از ديگر هرپس‌ويروسهاي حيوانات است.
گليكوپروتئين‌هاي ILTV مانند ديگر هرپس‌ويروس‌ها، مسئول ایجاد پاسخ‌هاي ايمني سلولي و همورال هستند و 5 نوع گليكوپروتئين غشايي مهم با اسامی gp60, gK, gX, gD, gC, gB و با وزن‌هاي مولكولی 205و 160 و 115 و 90 و 60 KD ايمونوژن‌هاي اصلي ويروس ILT هستند.
تكثير ويروس:
تكثير ويروس ILT مشابه ديگر آلفا هرپس‌ويروس‌ها نظيرويروس هاري كاذب و ويروس هرپس‌سيمپلكس است. عفونت، با چسبيدن ويروس به رسپتورهاي سلول شروع می شود، متعاقب آن غشاي ویروسی با غشاي پلاسمايي سلول ميزبان يكي مي‌شود. نوكلئوكپسيد به داخل سيتوپلاسم سلول، وارد شده و بطرف غشاي هسته انتقال داده مي‌شود. DNA ويروسي از داخل نوكلئوكپسيد آزاد شده و از طريق منافذ موجود در غشا به طرف هسته حرکت مي‌كند.
رونوشت برداري و تكثير DNA ويروس در داخل هسته سلول صورت مي‌گيرد. تقريباً70 پروتئين ويروسی توليد مي‌شوند كه تعدادي از آنها آنزيم و تعدادي نيز پروتئين‌هاي اتصالي به DNA هستند و این پروتئین ها تكثير DNA ويروس را تنظيم مي‌كنند. ویروس های ساخته شده، غشاي خود را از طريق مهاجرت از ميان تيغه داخلي غشاي هسته اخذ مي‌كنند. ذرات غشاءدار شده از طريق شبکه اندوپلاسمي حرکت كرده و در داخل واكوئل‌هايي درسيتوپلاسم سلول تجمع مي‌يابند.
حساسيت به مواد فيزيكي و شيميايي:
ويروس ILT به مواد ليپولیتيك نظير اتروكلروفرم حساس است. آلودگی ناشی از ويروس ILT در دماي C4 و در حلال‌هاي مناسب به مدت چندين ماه حفظ مي‌شود. اما؛ در برابر حرارت به سرعت از بين مي‌رود به طوريكه در دماي C55 ، بعد از 15 دقيقه و در دماي C38 ، بعد از 48 ساعت غيرفعال مي‌شود.
بنا بر گزارشی، توانايي ماندگاري ويروس ILT در دماي 23-13 درجه سانتي‌گراد در ترشحات ناي و لاشه جوجه به مدت 100-10 روز است.
محلول 3درصد كروزول و 1درصد lye ، ويروس را در عرض يك دقيقه غيرفعال مي‌كند.
سطوح میز آزمايشگاهی در صورت آلوده شدن به ويروس ILT با استفاده از يدوفورهاي تجاري و يا مخلوطي ازد ترجنت- هالوژن به راحتی پاك مي‌شوند.
آزمايش‌هاي انجام شده با آئروسول‌هاي ريز پراكسيد هيدروژن 5 درصد نشان داد كه؛ گازدهي با اين ماده ضدعفونی کننده، سبب غيرفعال شدن كامل عفونت‌زايي ويروس ILT موجود بر روي وسايل و تجهيزات سالن‌هاي مرغداري مي‌گردد.
طبقه‌بندي سويه ها:
آنتي ژنيسیتي:
براساس آزمايش‌هاي VN و ايمونوفلورسانس و نیز مطالعات مبتني بر محافظت متقاطع، سويه‌هاي ويروس لارنگوتراكئيت، از لحاظ آنتي‌ژنيكي هموژنوس هستند. ولي؛ به هرحال تفاوت‌هاي آنتي‌ژنيكي كمي میان سويه‌ها مشاهده مي‌شود.
بيماريزايي:
بیماریزایی سویه های فوق حاد،حاد و تحت حاد ویروس ILT در پرنده ها متفاوت می باشد.
یکسری از سويه‌هاي بسيار حاد ويروس ILT مرگ‌ومير بسيار بالايي را ایجاد می کنند و سويه‌هاي باحدّت كم ویروس ILT عفونتهای خفيف و يا غير واضحي را بوجود مي‌آورند.سويه‌هاي ويروس ILT از لحاظ حدّت‌شان در جنين ماكيان، شكل و اندازه پلاك در كشتهاي سلولي وغشاي كوريوآلانتوئيك تخم‌مرغ‌هاي نطفه‌دار ماكيان نیز با همديگر تفاوت دارند.
بررسی چگونگی مرگ‌ومير جنین در تخم‌مرغ جهت تمايز سويه‌هاي ويروس ILT پيشنهاد شده است؛ این الگوي مرگ‌وميرجنینی ارتباط نزديكي باحدّت ويروس دارد.
طبقه‌بندي مولكولي:
روشهاي مورد استفاده در اين نوع طبقه‌بندي عبارتند از: آناليز اندونوكلئاز محدودكننده DNA ويروسي[6]، ارزيابي‌هاي هيبريداسيون DNA[7] و [8]PCR/RFLP. محققین نشان داده‌اند كه شكستن DNA ويروسي با استفاده از اندونوكلئاز محدود کننده وجداسازي قطعات آن با کمک الكتروفورز، قادر به تمايزسويه‌هاي‌متفاوت‌ويروس IL مي‌باشند.درمطالعات همه گیرشناسي با استفاده از اندونوكلئازمحدودکننده و آناليز DNA ويروسي، سويه‌هاي فيلدي ویروس از سويه‌هاي واکسینال آن کاملا تفریق می شوند. از طرفی ؛ ويروسهاي واكسینال و جدايه‌هاي فيلدي ویروس با استفاده از PCR/RFLP به صورت موفقيت‌آميزي از یکديگر تفريق داده شده‌اند.
ميزبانهاي آزمايشگاهي:
ويروس لارنگوتراكئيت در تخم‌مرغ جنين‌دار و در بعضی كشتهاي سلولي تكثير مي‌یابد. در تخم‌مرغ جنين‌دار، در اثر نكروز و واكنش‌هاي تكثير بافتي ایجاد شده توسط ویروس، پلاك‌هاي كدری بر روي غشاي كوريوآلانتوئيك ایجاد می گردد. پلاك‌ها دو روز پس از تلقيح، قابل مشاهده بوده و مرگ جنيني 12-2 روز پس از تلقيح به وقوع مي‌پيوندد. با انجام پاساژهاي اضافي، زمان ماندگاري جنين‌هاي تلقيح شده كاهش مي‌يابد. جهت تکثیر این ويروس، سلول های كبد(CEL) و كليه (CK) جنين جوجه مناسب‌ترين سلول برای کشت هستند. سلولهاي كليه وريه جنين جوجه و غشاي كورويوآلانتوئيك تخم‌مرغ نیز برای جداسازی این ویروس مناسب هستند ولی؛ از حساسیت کمتری برخوردارند.
سلولهاي فيبروبلاست جنين جوجه، سلولهاي Vero و سلولهاي متعلق به بلدرچين، جهت كشت ويروس لارنگوتراكئيت نامناسب هستند.
در محیط کشت سلولی ویروس، آثار پاتولوژيک سلولي ایجاد شده عبارتند از: افزايش کبودی و تورم سلولي، جابه‌جايي غيرطبيعي كروماتين و گرد شدن هسته سلول ها .از طرفی؛ با يكي شدن و ادغام سيتوپلاسم سلولها، سلولهاي غول‌پيكر چندهسته‌اي تشکیل مي‌گردد.
گنجیدگی داخل هسته‌اي 12 ساعت پس از تلقيح ويروس به کشت سلول قابل مشاهده بوده و در طی 36-30 ساعت پس از تلقيح ويروس، به حداكثر خود مي‌رسد.
تكثير ويروس لارنگوتراكئيت درمحیط کشت لکوسيت پرندگان به خوبی انجام می گیرد. در حالیکه؛ لنفوسيت‌ها، تيموسيت‌ها، لکوسيت‌هاي بافي كوت و سلولهايT فعال، تا حدودی در برابر تكثير این ويروس مقاومت مي‌كنند. تكثير ويروس در کشت سلولهاي نامیرای کبد ماکیان (LMH) نياز به سازگاري قبلي داشته و جهت اهداف تشخيصی در جداسازي اوّليه ويروس نامناسب می باشد.
بيماريزايي و همه‌گيرشناسي:
شيوع وانتشار:
ويروس لارنگوتراكئيت در اكثر كشورها شناسايي شده و يك بيماري جدّي در گله‌هاي حساس طيور به شمار مي‌رود. در كشورهايي با سيستم توليد متراكم و صنعتي، بيماري لارنگوتراكئيت در گله‌هاي تخم‌گذار با استفاده از واكسيناسيون با واكسن‌هاي زنده به خوبی كنترل مي‌شود. در جوجه‌هاي گوشتي، دوره رشد، كوتاه مدت بوده و با رعايت دقیق مسائل قرنطينه‌اي، مي‌توان نياز به انجام واكسيناسيون را كاهش داد. در كشورهاي پيشرفته ويروس لارنگوتراكئيت در طيوربومي و خانگي به صورت اندميك وجود دارد.
ميزبانهاي طبيعي و آزمايشگاهي:
ماكيان، اولین ميزبان طبيعي ويروس لانگوتراكئيت هستند. هرچند كه بيماري در همه سنين ديده مي‌شود. ولي؛ علايم مشخصه بيماري بيشتر درپرنده‌هاي بالغ مشاهده مي‌گردد. تكثير ويروس به بافت‌هاي تنفسي محدود شده و معمولا وایرمی در میزبان دیده نمی شود و یا به ندرت اتفاق می افتد..
محققان شکلی از اين بيماري را در قرقاول و نژادهاي مخلوط قرقاول-ماكيان شناسايي كرده‌اند. درضمن ؛ محققان توانسته اند جراحاتي از این بیماری در بخش فوقاني مجراي تنفسي بوقلمون‌هاي جوان ايجاد كنند. به نظر مي‌رسد كه سار، گنجشك، كلاغ، فاخته، اردك، مرغ شاخدار و كبوترها در برابر ويروس لارنگوتراكئيت مقاوم هستند. به هرحال عفونت تحت باليني و موارد مثبت سرمي بیماری در اردك‌ها گزارش شده است.
تخم‌مرغ‌هاي جنين‌دارجوجه و بوقلمون در برابر ويروس لارنگوتراكئيت حساس بوده، تخم اردك حساسيت كمتری داشته. در حالیکه؛ تخم مرغ شاخدار و كبوتر هیچ گونه حساسيتي نسبت به آن ندارند.
انتقال، حاملین و ناقلین:
مجاری طبيعي ورود ويروس، قسمت فوقاني مجراي تنفسي مي‌باشد و بلع نيز به عنوان يك روش ايجاد آلودگي به شمارمی آید. ولی؛ در اين روش مواجهه اپيتليوم تنفسي، متعاقب بلع ضروري مي‌باشد. انتقال آلودگي بيشتر از طريق تماس با پرندگان درگير و در مراحل حاد بيماري اتفاق مي‌افتد و پرندگان حامل درآن نقش کمتری به عهده دارند.
انتقال مكانيكي ويروس در اثر استفاده از بستر و تجهيزات آلوده اتفاق مي‌افتد. در حالیکه؛ انتقال ويروس از طريق داخل و یا خارج تخم‌مرغ به جوجه گزارش نشده است.
دوره كمون:
علائم باليني بیماری 12-6 روز پس از مواجهه طبيعي پرنده با ویروس اتفاق مي‌افتد. اما؛ تلقيح تجربي ویروس از طريق داخل نايي منجر به كوتاه شدن دوره كمون در حدود 4-2 روز مي‌شود.
علايم باليني:
در اثر ويروس لارنگوتراكئيت فرم حاد بيماري تنفسي در ماكيان ایجاد مي‌شود. علايم باليني مشخصه بيماري شامل: ترشحات بيني و صدای رال‌هاي مرطوب تنفسي است كه متعاقب آن سرفه و بلع هوا مشاهده می شود.
تنگی نفس واضح و دفع موكوس آغشته به خون از مشخصات فرم اپي‌زئوتيك شديد بيماري مي‌باشد.
در سالهاي اخير در مناطقي از اروپا، استراليا، نيوزيلند و آمريكا كه پرورش و توليد طيور به فرم صنعتي و متراكم صورت می گیرد، فرم‌هاي انزئوتيك خفيف بيماري بيشتر مشاهده شده است. در اين نوع بيماري، علايم باليني عدم رشد، كاهش توليد تخم‌مرغ، التهاب بافت ملتحمه چشم و ترشحات چشمی، التهاب سينوس‌هاي زیر‌چشمي، التهاب و ترشح دائمي بيني مشاهده می شود.
طول دوره بيماري برحسب شدت جراحات ايجاد شده متغير است. معمولا بيشتر جوجه‌ها در طی 14-10 روز بهبود مي‌يابند. ولي؛ برخی مواقع، 4-1 هفته هم طول می کشد.
شيوع مرگ‌ومير:
اشكال اپي‌زئوتيك[9] شديد بيماري، دارای واگیری بالا (100-90درصد) و با تلفات بین 70-50 درصد می باشد ولی تلفات معمول آن 20-10درصد است. در حالیکه؛ اشكال انزئوتيك خفيف بيماري سبب شيوع بيماري در حدّ 5 درصد، با مرگ‌ومير بسياركم، در حد 2-1/0 درصد مي‌گردند.
پاتولوژي:
علايم كالبدگشايي:
جراحات بیماری لارنگوتراكئيت ممكن است در مخاط ملتحمه و داخل مجاری تنفسي ديده شود. اما؛ بيشتر جراحات در حلق وناي مشاهده می گردد. تغييرات بافتي در ناي و حلق ممكن است خفيف بوده و تنها یک افزايش موكوس در آنها ديده شود و يا ممكن است شديد بوده و تغييرات ديفتريك وخونريزي در مخاط ایجاد کند. در اشكال خفيف بيماري جراحات قابل مشاهده فقط شامل: التهاب مخاط ملتحمه، سينوزيت و تراكئيت موكوئيدي است. درشکلهای شديدتر در مراحل اولیه بيماري، التهاب موكوئيدي و در مراحل بعدي، دژنراسيون، نكروز وخونريزي در بافت دیده می شود . در این بیماری وجود تغييرات ديفتريك معمول بوده و ممكن است به صورت لخته های موكوئيدي در طول مجراي داخلي ناي كشيده شود. دربعضی ازپرنده‌هاي درگير، خونريزي شديد در داخل مجراي ناي ، موجب ايجاد لخته های خوني شده و يا اينكه خون با موكوس و بافت نكروتيك مخلوط می شود. التهاب، ممكن است از برونش به طرف پايين و به سمت ريه‌ها و كيسه‌هاي هوايي كشيده شود. در اشكال خفيف بيماري، ادم و پرخوني اپی‌تليوم ملتحمه و سينوس‌هاي زیر چشمي می تواند تنها ضايعه قابل مشاهده باشد.
علائم ميكروسكوپیک:
علائم ميكروسكوپيك در مراحل مختلف بيماري متفاوت است. تغييرات ميكروسكوپي اوّليه در مخاط ناي، شامل: از دست رفتن گابلت سل‌ها و نفوذ سلولهاي التهابي در مخاط بافتها مي‌باشد. با پيشرفت عفونت ويروسي، سلولهاي اپيتليوم تنفسي، بزرگ شده، مژك‌ها تخریب و ادماتوز مي‌شوند. سلولها چندهسته‌اي می شوند (سين‌سیتیا). و؛ بعد از سه روز لنفوسيت‌ها، هيستوسيت‌ها، و پلاسماسل‌ها به طرف مخاط و زيرمخاط بافت حرکت مي‌كنند. بعد ازتخريب و پوسته‌پوسته شدن سلولها، لايه نازكي از سلولهاي بازال ( بدون سلولهاي اپيتليومي) سطح مخاط را می پوشاند.
ممکن است سياهرگ‌هاي خوني داخل لاميناپروپريا ، در داخل مجراي ناي پاره شوند كه اين امر در مواردی که بافت اپیتلیومی تخریب می شود مشاهده می گردد .
سه روز پس از آلودگي،اجسام تجمعی داخل هسته‌اي[10] ویروس ديده مي‌شود. گنجیدگی به طور معمول فقط در مراحل اوليّه آلودگي (5-1 روز اوّل) مشاهده می شود و با پيشرفت‌عفونت در اثر نكروز و پوسته‌پوسته شدن سلولهاي اپيتليومي ناپديد مي‌شوند.
با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني معلوم شده كه اولين تغييرات سلولي، در هسته سلولهاي اپيتليومي و در طي تشكيل كپسيدهاي ويروسي اتفاق مي‌افتد. كپسيدهاي ويروسي از غشاي هسته جوانه زده، غشاي ليپيدي گرفته و به صورت توده‌هاي بزرگي در داخل واكوئل‌های سيتوپلاسمی سلول تجمع مي‌يابند. تورم ابري که با ميكروسكوپ نوري در مراحل اوليه تغييرات سلولي، در سيتوپلاسم سلول مشاهده می شود ناشی از تجمع توده های بزرگ ذرات ويروسي می باشد.
بيماريزايي مراحل عفوني:
آلودگي جوجه‌هاي حساس به ويروس لارنگوتراكئيت، منجر به تكثير ويروس در اپيتليوم حلق و ناي ونیز ديگر غشاهاي مخاطي نظير ملتحمه، سينوس‌هاي تنفسي كيسه‌هاي هوايي و ريه‌ها مي‌شود. سويه‌هاي ويروس لارنگوتراكئيت دراين بافتها بخصوص در ناي بسيار سيتولتيك هستند و امكان جراحت اپيتليومي شديد و خونريزي در آنها زیاد می باشد.
مطالعات متعددی نشان داده كه ويروس، 8-6 روز پس از آلودگي ، در بافت و ترشحات ناي یافت می شود و ممكن است به مقدار خيلي كم تا 10روز پس از تلقیح نيز حضور داشته باشد.
هيچ دليل و مدرک روشني مبنی بر وجود مرحله وايرمي در زمان عفونت ویروسی در پرنده وجود ندارد.
دفع مجدد ويروس ILT از مرغهای آلوده (كه بيماري در آنها به صورت نهفته وجود داشته است) بعد از قرار گرفتن در شرایط استرس زا و شروع تخمگذاری گزارش شده است.
از لحاظ باليني، عفونت پنهان و نهفته ويروس ILT در مجراي تنفسي پرنده ها، مهمترین چهره حضور LT در فارم های ماکیان مي‌باشد.
استفاده از داروهاي تضعیف کننده سيستم ايمني (نظير سيكلو فسفاميد و دگزامتازون) در فعال‌سازي دوباره ويروس نهفته ILT موفقیت آمیز نبوده است.
در یک بررسی فارمی که 16 هفته از درگیری آن فارم باLTV گذشته بود،میزان حاملین در گله 2درصد بود ؛ در بررسی دیگری،16 ماه پس از تلقیح سويه های وحشي استراليايي و واکسینال ویروس LT به ماکیان، عفونت نايي نهفته ، در حد 50 درصد بوده است؛ دراین بررسی، دفع ويروس ILT 20-7 هفته پس ازآلودگي ادامه داشته است.
ايمني
ايمني فعال:
پس از آلودگي با ويروس لارنگوتراكئيت، پاسخ‌هاي ايمني متفاوتي در پرنده ایجاد مي‌شود، آنتي‌بادي‌هاي خنثي‌كننده ويروس 7-5 روز پس از آلودگي قابل شناسايي بوده و در طی 21 روز به حداكثر خود مي‌رسند و پس از چند ماه از ميزان آن کاسته می شود. آنتي‌بادي‌هاي خنثي‌كننده ويروس ممكن است به مدت‌يكسال و يا بيشتر قابل شناسايي باشند. آنتي‌بادي‌هاي موجود در ترشحات ناي تقريباً 7روز پس آلودگي قابل شناسايي بوده و در طي 28-10 روز پس از آلودگي به حد ثابت‌خود مي‌رسند.
محققيین گزارش كردند كه با انتقال سلولهای طحال و لکوسیت های خون محیطی پرنده ایمن به پرنده حساس به LTV ، ایمنی در برابر آلودگی ایجاد می گردد. حساسيت جوجه‌ها در برابر ويروس لارنگوتراكئيت با افزايش سن كاهش مي‌يابد.از طرفی؛ خروس‌هاي نژاد گوشتي در مقايسه با مرغ‌ها دربرابر بيماري حساسيت بيشتري دارند . در شرایط استرس گرمایی (درجه حرارت بالای c35 )،نژادهای سنگین پرنده در مقایسه با نژادهای سبک از مقاومت کمتری در برابر بیماری برخوردار هستند.
«ايمني پاسيو و يا غيرفعال»
آنتي‌بادي‌هاي مادري ضد ويروس لارنگوتراكئيت، از طريق تخم‌مرغ به نتاج منتقل مي‌شوند، این آنتي‌بادي‌ها در برابر بیماری حفاظتی ایجاد نمی کنند. ضمن اینکه؛ سبب خنثی شدن ویروس واکسن نمی شوند وبا واکسیناسیون نیز تداخلی ایجاد نمی کنند.
«تشخيص»
ویروس لارنگوتراكئيت علائم باليني و جراحات مشابه ديگر عوامل بيماريزاي سيستم تنفسي پرنده را ايجاد مي‌كند. لذا؛ بررسی های آزمایشگاهی برای تشخیص بیماری نیاز می باشد. در مواردی که بیماری شدید وحاد بوده و تلفات در گله بالا می باشد و دفع خون نیز در پرنده مشاهده می شود، لارنگوتراكئيت مي‌تواند براساس علائم باليني تشخيص داده شود. بیماری لارنگوتراكئيت می تواند با استفاده از يك يا چند روش آزمايشگاهي تأييد گردد. اين آزمايش‌ها عبارتند از: مشاهده گنجیدگی های داخل هسته‌اي، جداسازي ويروس، شناسايي آنتي‌ژن‌هاي ويروسي دربافت نای و یا ترشحات موکوسی مجاری تنفسی و شناسايي DNA اختصاصي ويروس لارنگوتراكئيت و تست های سرولوژي.
تشخیص گنجیدگی های داخل هسته ای برای تأیید این بیماری بسیار اختصاصی است . ولی؛ در مقابل با روش جداسازی ویروس از حساسیت کمتری برخوردار است.
«جداسازي و شناسايي ویروس»
برای جداسازي ويروس لارنگوتراكئيت، سوسپانسيون اکسودا مجاری تنفسي، مخاط ملتحمه و يا ماده هموژن تهيه شده از بافت آلوده به غشاي كوريوآلانتوئيك تخم‌مرغ جنين‌دار 12-9 روزه و يا به كشتهاي سلولي حساس تلقيح مي‌شود.در ضمن ؛ از ناي، حلق، ريه، مخاط ملتحمه و يا اگزودايي مشکوک سواب تهيه می شود. معمولاً برای جداسازی این ویروس از روش تلقيح به غشاي كوريوآلانتوئیک استفاده می شود. زیرا؛ اين روش حساستر از روشهاي ديگر تلقيح به داخل تخم‌مرغ بوده و منجر به گرفتن تيتر ویروس معادل 2*10 يا بالاتر می گردد. سلولهاي كبد جنيني (CEL) جوجه و سلولهاي كليه (CK) جوجه، مناسب‌ترين كشتهاي سلولي براي جداسازي ويروس لارنگوتراكئيت مي‌باشند. سلولهای كبدی جنین جوجه ، حساسترين ميزبان آزمايشگاهي براي جداسازي ويروس لارنگوتراكئيت مي‌باشد. کشت در سلولهاي CEL و یا CK نسبت به تلقيح، به غشاي كوريوآلانتوئيك تخم‌مرغ جنين‌دار ترجیح داده می شود. روشهاي مختلفي برای تشخيص لارنگوتراكئيت شناخته شده است كه عبارتند از: تست های استفاده از آنتي‌بادي فلورسانت (FA)، ايمنوپروكسيداز (IP)، الايزا (ELISA)، ميكروسكوپ الكتروني، تكنيك‌هاي هيبريداسيون DNA و تكنيك‌هاي PCR. آنتي‌ژن‌هاي ويروس لارنگوتراكئيت را مي‌توان از روز دوم تا چهاردهم پس از آلودگی و با استفاده از روش آنتی‌بادی فلورسانت در بافت نای تشخيص داد وعده ای از محققان زمان متفاوتی (8-6 روز) را برای این آزمایش توصيه نموده‌اند.
محققين با استفاده از IP، قادر به شناسايی آنتی ژن‌های ويروس لارنگوتراكئيت، از روز يكم تا نهم پس از آلودگي (PI) در بافت ناي گرديدند. در این مطالعه نشان داده شد كه؛ روش IP حساستر از روش FA براي شناسايي ويروس لارنگوتراكئيت در بافتها مي‌باشد. محققان دیگر نشان دادند که روش الايزا با استفاده از آنتی بادی مونوكلونال ، به‌اندازه جداسازي ويروس دقيق بوده،ولی؛ سريعتراز آن انجام می شود. مضافاً اینکه این تست جهت شناسايي ويروس لارنگوتراكئيت، از FA و AGPT دقيق‌تر است.
برای تشخيص لارنگوتراكئيت، با ميكروسكوپ الكتروني، مستقيماً از نمونه های نای استفاده می شود. اين روش زماني موفقيت‌آميز است كه تعدادی از ذرات ويروسي در نمونه‌هاي باليني مشاهده گردد.
محققي جهت شناسايي ويروس لانگوتراكئيت از هيبريداسيون دات بلات و قطعات DNA ويروسي كلون شده ( نشان‌دار با ديگوكسي ژنین[11]) استفاده كرد. و؛ نشان داد كه اين روشها براي شناسايي ويروس عامل بيماري در جوجه‌ها هم درمرحله بسيار حاد بيماري و هم در جوجه‌هايي كه از بيماري شفا يافته‌اند، بسيار حساس وسودمند مي‌باشد. در ضمن؛ اين روشها زمان بيشتری برای جداسازي ويروس و الايزا نمي‌برند. اين‌آزمايش‌ها روشهاي سريع براي شناسايي جوجه‌هايي هستند که در آنها بيماري به شکل نهفته وجود دارد. روشهاي هيبريداسيون in situ و PCR براي شناسايي DNA ويروسي نام برده شده اند. روش PCR حساستر از جداسازي ويروس مي‌باشد، بعلاوه PCR امكان شناسايي ويروس لارنگوتراكئيت را در نمونه‌هايي كه با ديگر ميكرو ارگانيسم‌ها نظير آدنوويروس‌ها آلوده شده‌اند نیز فراهم می کند.
«سرولوژي»
براي شناسايي آنتي‌بادي‌هاي ويروس لارنگوتراكئيت در سرم‌پرنده‌ها، روشهای مختلفي استفاده شده است. که؛ عبارتند از: [12]AGID، خنثي‌سازي ويروس (VN)، آنتي‌بادي فلورسانت غيرمستقيم (IFA) و الايزا . اين روشها ممكن است براي شناسايي ويروس لارنگوتراكئيت در كشتهاي سلولي آلوده و غشاي كوريوآلانتوئيك به كار برده شوند، مقايسه بین، آزمايش‌هاي IFA , VN , AGID و الايزا نشان داده است كه همه آنها روشهاي معتبري براي شناسايي و اندازه‌گيري آنتي‌بادي‌هاي مربوط به ويروس‌لارنگوتراكئيت هستند. حساسيت الايزا در مقايسه با تست VN كمي بالاتر بوده و قابل مقايسه با IFA مي‌باشد، در این میان AGID كمترين حساسيت را دارد. هر دو تست الايزا و IFA ، مزاياي سرعت و حساسيت را دارند. ولی؛ تست الايزا در مواردی که بایستی از تعداد زيادي سرم، آزمایش به عمل آید، مناسب تر است.
«تشخيص تفريقي»
بیماری لارنگوتراكئيت از ديگر بيماريهای تنفسي پرنده‌ها که علائم باليني مشابه با این بیماری ایجاد می کنند، تفريق داده می شود. اين بيماري‌ها عبارتند از: فرم ديفتريك آبله پرنده‌ها، نيوكاسل، آنفولانزاي مرغي، برونشيت عفوني، عفونت ناشی از آدنوويروس‌ماكيان و آسپرژيلوز.
«روشهای کنترل بیماری »
روشهاي مديريتي:
مواجهه پرنده با ویروس فيلدي و يا ویروس واکسن ، منجر به‌ايجاد پرندگان حامل مي‌گردد؛از اینرو پرندگان واكسينه يا بهبود يافته، نبایستی با جوجه‌هاي حساس، مخلوط شوند، لذا داشتن تاريخچه كامل گله‌هاي مادر جهت جلوگیری ازمخلوط كردن آنها با يكديگر ضروري مي‌باشد. برای پيشگيري و كنترل موفقيت‌آميز لارنگوتراكئيت، قرنطينه منطقه‌اي و استفاده از مواد ضدعفوني‌كننده در مسیر عبورومرور افراد، دان، وسايل و تجهيزات و پرنده‌هاي آلوده لازم و ضروري است.
حضور بيماري لارنگوتراكئيت، بايستي در پرندگان بومی و گله‌هاي نمايشي ماكيان تشخيص داده شده و در برابر آنها اقدامات كنترلی مناسب انجام گيرد. در مورد همه‌گيري‌هاي لارنگوتراكئيت، همكاري میان دولت و صنعت طيور بسيار سودمند خواهد بود. اين همكاري ممكن است نياز به استفاده وسيع از واكسن‌هاي لارنگوتراكئيت را غيرضروري سازد.
در همه‌گيري بيماري، گله‌هاي بهبود يافته، به سرعت و در شرایط قرنطينه ای برای كشتار فرستاده می شوند. سودمندترين روش براي كنترل‌همه‌گيري لارنگوتراكئيت، تلاشي هماهنگ جهت تشخيص سريع بيماري و اجرای برنامه واکسیناسیون می باشد تا از شیوع بیشتر ویروس جلوگیری به عمل آید. در صورت بروز يك همه‌گيري، واكسيناسيون به صورت مؤثري از شيوع ویروس جلوگیری کرده و دوره بيماري راكاهش می دهد. با استفاده از رعایت معيارهاي صحیح بيوسكوريتي، از شيوع ویروس بین مناطق مختلف پيشگيري به عمل می آید. ويروس لارنگوتراكئيت در خارج از سالن مرغداري با استفاده از ضدعفوني‌كننده های مناسب و ماندن در هوای گرم از بين می رود. بنابراين؛ جهت پيشگيري از بروز بيماري بایستی حمل‌ونقل وسايل و تجهيزات بين گله‌هاي مختلف با دقت پس از شستشو و ضدعفوني وسايل انجام گیرد. لاشه‌های آلوده ، پر، دان، آب ، بستر و سایر وسایل آلوده با دقت از مرغداري بيرون برده و به شکل صحیح نابود شوند. ساختمان‌ها و تجهيزات بايد به دقت شسته شده و سپس با موادضدعفوني‌كننده نظير: فنل‌ها، سديم هيدروكلريت، يدوفرها و يا تركيبات آمونيوم 4 تايي ضدعفوني شوند. در ضمن؛ بایستی ضدعفوني‌كننده‌ها با رقّتی كه توسط كارخانه‌ها توصيه شده است، استفاده شوند.
«واكسيناسيون»
واكسيناسيون روش مناسبی براي ايجاد مقاومت درگله‌هاي حساس مي‌باشد. پرندگان واکسینه شده به حاملین نهفته ویروس ILT تبدیل می شوند، از اینرو توصيه شده كه واكسيناسيون فقط در مناطق جغرافيايي، كه بيماري درآن مناطق اندميك شده، استفاده شود.
«واكسن‌هاي زنده تخفيف حدت يافته»
ايمونیزاسیون در برابر لارنگوتراكئيت، اولين بار با تلقيح ويروس حاد به كلواك جوجه‌ها بطور موفقيت‌آميزی ایجاد شد. متعاقب آن دريافتند كه با استفاده از واكسيناسيون جوجه‌ها با ويروسهاي زنده، از طريق سينوس‌هاي زیر چشمي، تلقيح به داخل بيني ، فولیکول های پر، قطره داخل چشمي و آشاميدني ايمني ایجاد می شود.
سويه‌هاي فيلدي ويروس لارنگوتراكئيت، با استفاده از پاساژهاي متوالي دركشت‌هاي سلولي و تخم‌مرغ‌هاي جنين‌دار و تلقيح به فولیكول‌هاي پر ماکیان تخفيف حدت می یابند. بايد دقت كافي به عمل آيد تا، دز ويروس براي ايجاد ایمنی مطلوب، كافي باشد. طی مطالعات به عمل آمده،جهت ایجاد ایمنی مناسب علیه بیماری LT ، درهمه روشهاي تجويز واكسن (غیر از روش آشامیدنی)، بايد حداقل [13]PFU/mv 102 ویروس وجود داشته باشدو در واكسيناسيون به روش آشاميدني ، غلظت ويروس بايستي [14]EID 510 باشد.
تجويز واكسن‌هاي زنده تخفيف حدت يافته در آب آشاميدني و يا به صورت واکسیناسیون سریع و اسپري، روشهاي مناسبی هستند كه میتوان همزمان در گله های بزرگ طیور انجام داد. ولي؛ به هرحال مشكلات متعددي همراه با اين روشهاي واکسیناسیون وجود دارد.
گزارش ها نشان می دهد كه؛ درتجویز واكسن لارنگوتراكئيت به روش آب آشاميدني تعداد زیادی از جوجه‌ها ايمني مناسب را به دست نمی آورند.
واكسيناسيون موفقيت‌آميز از طريق آب آشاميدني، نيازمند رسيدن ويروس واكسن به سلولهای اپيتليومي حساس بيني مي‌باشد، كه اين عمل در اثر آسپيراسيون و هدایت ويروس به شكاف و حفره‌هاي بيني انجام مي‌گیرد . تجویز غلط واكسن‌هاي لارنگوتراكئيت با استفاده از روش اسپري، ممكن است منجر به ايجاد واكنش‌هاي شديد گردد. که؛ می تواند ناشی از تخفيف حدت نامناسب ويروس واكسن، نفوذ ویروس به قسمت تحتانی مجاری تنفسي به علت ریز بودن قطرات اسپري و يا در اثرافزایش غلظت ویروس واکسن باشد. واكسن‌هاي زنده تخفيف حدت يافته دارای معايبي هستند، شامل: انتشار ويروس واكسن به پرندگان غير واكسینه، تخفيف حدت يافتن نامناسب ویروس واكسن، ايجاد پرنده‌هاي حامل نهفته و افزايش حدت ويروس در اثر پاساژ in vivo (پرنده به پرنده) . نشان داده شده كه ويروس واكسن لارنگوتراكئيت به آساني از پرندگان واكسينه به پرندگان غيرواكسينه انتشار مي‌يابد. که؛ باید از اين نوع شيوع ممانعت به‌عمل آيد. زیرا؛ انتشار ويروس به پرنده‌هاي غيرواكسينه، منجر به پاساژ in vivo شده و احتمال برگشت حدت ويروس واكسینال به ويروسهاي حاد را افزایش می دهد. دو نوع ويروس واكسن تخفيف حدت يافته وجود دارد: واکسن با منشأ جنين جوجه (CEO)[15] و ديگري ويروس واکسن با منشأ كشت بافتی (TCO)[16] که به شکل متوالی در جوجه‌هاي SPFپاساژ يافته‌اند. طی مطالعه ای محققان نشان دادند که پس از ده پاساژ متوالي، ويروسهاي واكسن تخفيف حدت يافته (CEO)، افزايش حدت یافته ولی؛ ويروس بامنشأ TCO افزايش حدت، پیدا نکرده است. افزايش حدت ویروس واکسینال در حدی بود كه با سويه رفرانس بسيار حاد و ويروس لارنگوتراكئيت(Illinois N71851 strain,A tcc VR-783) قابل مقایسه بود. تصور می شود که؛ افزايش حدت ويروس واكسن های تخفيف حدت يافته در نتيجه تجویز این واکسن ها همراه با آب آشامیدنی، و عدم رعایت مناسب مسایل بهداشتی و امنیتی اتفاق مي افتد.
«واكسن‌هاي كشته»
نشان داده شده كه اين نوع واكسن‌ها، قادر به تحريك سیستم ايمني در جوجه‌ها بوده و درجات متفاوتي از محافظت را به هنگام مواجهه با ويروس لارنگوتراكئيت، به وجود مي‌آورند. هر چند؛ امكان استفاده از اين واكسن‌ها در سطح فارم، به علت هزينه بالای تهيه آن وقيمت تمام شده، مورد تردید مي‌باشد.
«واكسن‌هاي براساس تكنولوژي DNA بازآرايي شده»
محققي ويروس لارنگوتراكئيت بازآرايي شده را از طريق بيان ژن ماركربتاگالاكتوزيداز به صورت ورود به داخل يك ORF ژن DNA ويروس ایجاد نمود؛ محقق ديگري ويروس لانگوتراكئيت بازآرايي شده را كه فاقد تياميدين كنياز مي‌باشد(يك فاكتورحدت هرپس ويروسي) از طريق داخل نمودن ژن ماركر LAC-Z به داخل ژن تيامدين كنياز DNA ويروسي تولید نمود؛ هرپس ويروس بوقلمون بازآرايي شده (HVT) كه شامل ژن‌هاي LTV بود، ايمني ايجاد شده پس از تجویز آن به اندازه ایمنی ناشی از واكسن‌هاي زنده‌تخفيف حدت يافته بود، اين نوع واكسن همراه با اجراي مقررات‌قرنطينه‌اي و معيارهاي بهداشتي جهت برنامه‌هاي ريشه‌كني منطقه‌اي ويروس‌لارنگوتراكئيت مي‌تواند بكار برده شود.
«برنامه هاي واكسيناسيون در سطح فارم»
جوجه‌های یکروزه هم می توانند واکسن LT را دریافت نمایند. اما؛ در جوجه های کم سن به خصوص زیر 2 هفته، به خوبی جوجه های بالغ، ایمنی ایجاد نمی شود. مضافاً اینکه راکسیون واکسیناسیون در جوجه های جوانتر خیلی بیشتر می باشد. در صورت استفاده از واکسن های تخفیف حدت یافته در جوجه های سنین بالاتر از 2 هفته و یا هنگامی که این جوجه ها با ویروس فیلدی تماس پیدا می کنند، ایمنی بعد از 4-3 روز در آنها ایجاد شده و پس از 8-6 روز کامل می شود. ضمن اینکه؛ 15-8 هفته پس از واكسيناسيون کاهش ایمنی در این پرنده ها مشاهده می شود. در حالت فيلدي، معمولاً 20-15 هفته پس از واكسيناسيون سطح ایمنی در گله ها کاملاً فروکش نموده و شکسته می شود. به هر حال؛ هنوز لزوم واكسيناسيون دوباره گله، زير سؤال مي‌باشد. واكسيناسيون دوباره با واكسن‌هاي زنده ممكن است در افزایش ايمني گله مؤثر نباشد. زیرا؛ ويروس واكسن، به وسیله ايمني (آنتی بادی ) موجود خنثي شده و ازتكثير ويروس واكسن جلوگيری به عمل می آید. در گله‌های تخم‌گذار چند سنی، لارنگوتراكئيت به خوبی با استفاده از واكسيناسيون واكسن‌های زنده تخفيف حدت يافته كنترل می شود. گله‌هاي تخم‌گذار به صورت معمول، دوبار قبل از شروع توليد واكسينه مي‌شوند. و؛ معمولاً اولین واكسن با روش قطره چشمی در سن 7 هفتگی و واکسن دوم در سن 15 هفتگی و به صورت قطره چشمي، اسپري، يا آب آشاميدني تجویز مي‌شوند.
روش قطره چشمی در مقايسه با انجام واکسیناسیون به صورت اسپري و از راه آب آشاميدنی، ايمني یکنواختی را به وجود می آورد. در پرورش جوجه‌هاي گوشتي، به علت كوتاه مدت بودن دوره، پرورش جوجه‌های یک سن و افزایش مسایل بهداشتی و بيوسكوريتي، نياز به واكسيناسيون علیه LT کمتر احساس می شود. ولي؛ در صورت وجود ابتلای احتمالی به همه‌گيری‌های لارنگوتراكئيت، واكسيناسيون در گله‌های گوشتی نيز لازم مي‌شود. در اين شرايط، گله‌های گوشتی به صورت معمول در سن 12-10 روزگی از طريق آب آشاميدنی واكسينه می گردند .
درمان:
هيچ دارويي برای كاهش شدت جراحات و يا از بين بردن علائم باليني ناشی از بيماري LT مؤثر نمی باشد. اگر واگیری لارنگوتراكئيت زود تشخيص داده شود، ممکن است با واكسيناسيون سریع وبه موقع پرندگان غير درگير بتوان ایمنی مناسی را قبل از بیمار شدن آنها ایجاد نمود.
«ريشه‌كني»
به علت خصوصيات بيولوژيكي و اكولوژيكي متعدد ويروس لارنگوتراكئيت، ريشه‌كني ويروس از سيستم های توليدي متراكم طيور، امكان‌پذير می باشد. اين خصوصيات عبارتند از: اختصاصيت شدید ميزباني ويروس لارنگوتراكئيت، آسیب پذیر بودن ويروس در خارج از بدن ميزبان و ثبات آنتي‌ژنيكي ژنوم لارنگوتراكئيت.
جوجه‌ها میزبان اصلی و مخزن ويروس لارنگوتراكئيت هستند، به نظر می رسد پرندگان وحشی مخزن این ویروس نبوده و یا در اكولوژي ويروس لارنگوتراكئيت اهميت كمي داشته باشند. گله‌هاي بومی و زينتي، مخازن ويروس لارنگوتراكئيت هستند. بنابراين؛ هر گونه تلاش برای ريشه‌كني بيماري، بايستي مبتني بر شناسايي ويروس در اين نوع از پرنده‌ها باشد. سويه‌هاي ويروس لارنگوتراكئيت از لحاظ آنتي‌ژنيكي هموژنوس هستند.
بنابراين استفاده از يك نوع واكسن ويروس لارنگوتراكئيت، ايمني متقاطعی در برابر همه سويه‌های ويروسLT به وجود مي‌آورد. ريشه‌كني ويروس لارنگوتراكئيت نيازمند توسعه تولید واكسن‌هاي نوترکیب است كه سبب ايجاد ايمني، بدون ایجاد جوجه‌هاي حامل نهفته مي‌گردند.
[1] Laryngotracheitis
[2] Herpesviridae
[3] Alphaherpesvirinae
[4] Gallid herpesvirus 1
[5] herpes simplex virus
[6] restriction endonuclease analyses of viral DNA
[7] DNA hybridization assays
[9] epizootic
[10] Intranuclear inclusion bodies
[11] digoxigenin
[12] agar-gel immunodiffusion
[13] plaque-forming unit
[14] embryo infective doses
[15] chicken embryo—origin
[16] tissue culture—origin
No comments:
Post a Comment