روش هاي سرولوژيك موجود در تشخيص بيماري مايكوپلاسموز

دکتر محمد صادق مددی      رزیدنت دوره تخصصی بیماریهای طیور دانشگاه تهران

دکتر مرتضی راعی            بخش طیور سازمان دامپزشکی کشور

ارائه شده در چهاردهمین کنگره دامپزشکی کشور

 روش هاي تشخيصي سرولوژيك ، براي پايش گله ها  دربرنامه كنترلي مايكوپلاسما گالي سپتيكوم مفيداست .اين تستهمچنين به عنوان يك وسيله كمك تشخيصي، وقتي كه  مشكوك به عفونت باشيم،استفاده مي شود. وجود يك تست سرولوژيك مثبت با تاريخچه وعلائم تيپيك  بيماري مايكوپلاسما گالي سپتيكوم فرد را بوجود بيماري مشكوك نموده وجداسازي و تعيين هويت ارگانيزم صورت ميگيرد.تشخيص سرولوژيكي بيماري با تست هاي RSA ، اليزا و باروش ملكولي، تست PCR صورت ميگيرد.استفاده از تست PCR اخيرا“بوسيله مرغدارها مرسوم گرديده است .تست RSA به عنوان تست غربالگر با حساسيت خيلي بالا استفاده مي شود. اين تست به علت ارزان بودن ، دردسترس بودن ، سرعت وقابليت راحت اجرايي وحساسيت با لا به عنوان يك تست غربالگرمطلوب در صورت وجود موارد  مثبت انجام ميگيرد ولي از طرف ديگر به علت داشتن ويژگي پايين ومخصوصا“ وجود  مثبتهاي كاذب در نتايج حاصله از آن، نيازبه تست هاي مكمل دارد.

 درصورتي كه نمونه هاي اخذ شده تحت شرايط لازمه ،دماي مناسب و رقت يك چهارم و يا بيشتر انجام شده باشد وميزان مثبت هاي اخذ شده اين تست برابر يك دهم  نمونه هاي گرفته شده باشد اين نمونه ها درمرحله اول مثبت تلقي مي گردند، لكن به علت محدويت هاي اين تست وهمچنين جهت تاييد نتايج حاصل از آن، ازتست HI يا اليزا نيز براي تاييد نتايج حاصله از آن استفاده مي شود هر چند كه درطول يك تاسه هفته بعد از درگيري گله با ‏‏‏‎Mg ،آنتي بادهاي مربوطه  توسط تست RSA بهتراز تست اليزا و HI تشخيص داده شده اند.(26)

HI:

 با توجه به اينكه آنتي ژن  مایکوپلاسما  به شكل تجاري موجود نمي باشد واستفاده ازاين تست مشكلات خاص خودرا  داردوبا عنايت به اينكه كيت هاي آزمايش اليزا به شكل تجاري موجود مي باشند، استفاده ازالیزا هم اينك رايج گرديده است . البته اين تست در مقايسه با RSA  حساسيت كمتري داشته ولي ويژگي آن با لا تر ميباشد .(24و25)

 HI ميتواند منفي هاي واقعي را استخراج نموده ودرصورت تاييد، بقيه نمونه ها، مثبت محسوب مي شوند. ولي با توجه به اينكه  اين تست ها نيزمشكلات خاص خودرا دارندو امكان خطاي آزمايشگاهي ، واكنش متقاطع با ديگرعوامل مثل MS ،MI ، واكنش  هاي پس ازواكسيناسيون ( روغني ) و……… غيره مي تواندجاي شك وشبهه را جهت تاييد نهائي باقي گذاردو با توجه به عواملي كه مي توانندنتايج را تحت تاثيرقراردهند، توصيه شده است كه درطول يك ماه بعد  مجددا“ تست تكرارگردد. لكن با توجه به مواردفوق، يك تشخيص قوي بايدبرپايه جداسازي عامل بيماري اتفاق بيفتد.

با توجه به اينكه جداسازي عامل ، عملي زمان بر و هزينه بربوده و حوصله با لا وانجام عمليات ويژه اي را نياز دارد كه موفقيت درآن مستلزم وجود يكسري از عوامل وتجهيزات و  وجود نيروي انساني متبحرمي باشد وبراي قضاوت سريع  جهت تعيين تكليف تست ها ضروري مي باشد، پيشنهاداستفاده ازروش ملكولي با تست PCR  مي تواندتست  جايگزين مناسبي براي جداسازي مايكوپلاسما باشد، زيرا با جداسازي DNA عامل،  ظرف چندساعت عمل تشخيصي صورت ميگيرد.

آنتي ژن SPA براي تشخيص آنتي بادي هاي مايكوپلاسما گالي سپتيكوم به شكل تجاري دردسترس هست.آزمايش SPA تست حساس  ونسبتا“ ارزان وسريعي ميباشد.اين تست درمراحل اوليه به عنوان  تست غربالگر براي پايش گله ها وتشخيص سرمي مورداستفاده قرارمي گيرد. اگرچه راكتورهاي غيراختصاصي دربعضي گله هاي آلوده به مايكوپلاسما سينوويه ازطريق آنتي ژن هائي كه واكنش متقاطع ايجادمي كنند ،ديده ميشود.موارد ديگر اينگونه واكنشها در گله هائي است كه اخيرا“ با واكسن هاي روغني با منشاء كشت بافتي واكسينه شده اند. واكنش هاي غيراختصاصي اصلي ممكن است بوسيله رقيق نمودن سرم كاهش يابند.

بعضي آزمايشگاهها رقت يك دوم يا بيشتر   سرم درسالين را آماده نموده و سرمي كه دريك هشتم يا بزرگتر واكنش دهدرا مثبت محسوب مي كنند كه ممكن است درتفريق بين واكنش هاي اختصاصي وغيراختصاصي مفيد باشد.

آزمايش SPA درتشخيص آنتي بادي  IgMمايكوپلاسما گالي سپتيكوم بسيار كارا ميباشد كه اولين كلاس ايمونوگلوبولين توليدشده درپاسخ به عفونت مي باشد.

تست اليزاجهت افزايش كارائي آزمايش وافزايش حساسيت و ويژگي نتايج    SPA و HI به كار مي رود.تست هاي سرلوژيكي كه استفاده معمول دارند ممكن است فاقد ويژگي يا حساسيت لازم بوده ومعمولا“ برا ي پايش گله ها توصيه مي شوندو براي  تست  انفرادي  پرندگان مناسب نمي باشند.چندين تست ديگرمثل:

IP    , Microimmuno Fluoresc ence  ،  Radioimmunoass

   نيز جهت سنجش سرولوژيكي مايكوپلاسما موجود ميباشد.

تست آگلوتينا سيون داخل لوله تستي براي برنامه كنترلي مايكوپلاسما گالي سپتيكوم دردهه هاي 60و 1970 بودولي الان به ندرت استفاده مي شود.

تست هاي سرلوژي كه بصورت معمول استفاده مي شوند ممكن است فاقدحساسيت يا ويژگي لازم باشند. معمولا“ اين تست ها براي پايش ( مونيتو رينگ ) گله ها استفاده شده و براي تست انفرادي پرندگان كاربردي ندارند .

 واكنش آنتي ژن وآنتي بادي يك واكنش تعادلي غيركولانس است كه اندازه گيري درنقطه تعادل ، دقيق وتكرارپذيراست ، لذادركليه روش ها سنجش ايمني زماني به نام انكوباسيون مطرح است كه درواقع براي تعادل رسيدن واكنش درنظرگرفته مي شود.(51و5)

A  ) تست آگلوتيناسيون سريع سرم. (RSAT )

تست RSA به عنوان يك وسيله كنترلي براي عفونت هاي  مايكوپلاسما ئي طيور مي باشد. اين تست خيلي حساس بوده وتغييرات سرمي بزودي پس ازعفونت شروع مي شود( درعفونت تجربي اين زمان حدوديك هفته مي باشد) . عليرغم محدويت هايي كه اين تست دارد درغربال گري اوليه گله ها و دربحث ريشه كني استفاده مي شود. اين تست حساسيت با لا و ويژگي پاييني را به همراه دارد لذا براي تصحيح اين مطلب تست مجددصورت مي گيرد. درفاصله اي كه تست مجددمي خواهدانجام شود، ممكن است تغييرات سرمي صورت گرفته ومثبت هاي كاذب كاهش يابد وحتي گله منفي شود. نمونه ها بايدبه دقت نمونه برداري شود ويك تست جانشين ( alternative (مانند كشت يا PCR  نيزدرنظرگرفته شود، ممكن است گله در طي اين مدت درقرنطينه قرارگيردتا اينكه وضعيت گله مشخص شود.

ماهيت مثبت هاي كاذب موردمطالعه قرارگرفته وتوليد آنتي ژن نيزپيشرفت نموده است اگر چه كيفيت و نتيجه كار مخصوصا“ در  مايكوپلاسما سينويه هنوز متغير ميباشد.

سرم هاي جمع آوري شده ازيك گله نبايد سريعا“ آزمايش شوندبلكه بايستي دردماي 4 درجه سانتيگراد ذخيره شوند( يخ زده نشوند)و موقع انجام، تست بايددر دماي اتاق انجام گيرد.

تست در طول مدت 72 ساعت پس ازجمع آوري سرم ها بايستي انجام پذيرد. انجام سانتريفيوژ، قبل ازآزمايش ميزانواكنش هاي غيراختصاصي را كاهش ميدهد.(17و44)

 

ممكن است آگلوتيناسيون مشاهده شده در آزمايشRSA  ناشي از تجمع خودبخودي ذرات آنتي ژن باشد لذا استفاده از كنترل بدون سرم جهت ارزيابي واكنشهاي مثبت كاذب الزامي است.به عبارت ديگر در يك گوده از صفحه پليت بجاي سرمی از PBS  و يا نرمال سالين استفاده و نتيجه آزمايش را مشاهده كرد. در صورتيكه نمونه هاي سرمي رقيق نشده در آزمايش RSA   مثبت تشخيص داده شوند بلافاصله از سرم هاي مذكور رقت تهيه و براي اطمينان آزمايش مجدد RSA الزامي است.

رقت سرم براي گله هاي مادر گوشتي 8/1 اعلام ميگردد.

قبل از شروع آزمايش آنتي ژن ها بايد به دماي محيط برسند و بشدت تكان داده شوند تا رسوب آنها حل شود.